【摘要】：研究背景：潰瘍性結(jié)腸炎是一種原因未明的結(jié)直腸炎性病變,隨著病程延長(zhǎng),癌變風(fēng)險(xiǎn)增加。但目前由于潰瘍性結(jié)腸炎癌變臨床病例積累需較長(zhǎng)的時(shí)間,存在一定難度,建立潰瘍性結(jié)腸炎癌變的動(dòng)物模型起到了重要作用。目前關(guān)于潰瘍性結(jié)腸炎動(dòng)物模型較多,近年來(lái),少數(shù)研究者發(fā)現(xiàn)小鼠飲用葡聚糖硫酸鈉和普通飲用水?dāng)?shù)個(gè)循環(huán),可有不典型增生和癌變的發(fā)生,但所需實(shí)驗(yàn)周期較長(zhǎng)并且癌變率低[1,2]。文獻(xiàn)報(bào)道予以小劑量AOM及1個(gè)周期2%葡聚糖硫酸鈉(DSS,分子量36,000-50,000)致炎刺激,可于短期內(nèi)(12周)建立潰瘍性結(jié)腸炎癌變的動(dòng)物模型[3]。關(guān)于潰瘍性結(jié)腸炎癌變的機(jī)制目前認(rèn)為Wnt途徑中的關(guān)鍵蛋白,β-catenin在潰結(jié)相關(guān)性結(jié)腸癌發(fā)病機(jī)制中起著關(guān)鍵作用。在散發(fā)性結(jié)腸癌發(fā)病機(jī)制中,APC突變通常被認(rèn)為是一個(gè)早期事件[4],而在潰瘍性結(jié)腸炎相關(guān)性結(jié)腸癌中早期相對(duì)少見(jiàn),而通常發(fā)生在晚期[5]。相反地,P53突變通常被認(rèn)為是“腺瘤——癌變”途徑的晚期事件[4],但在潰瘍性結(jié)腸炎患者中,P53突變通常在早期發(fā)生,而且可以在非不典型增生和未定義不典型增生的粘膜病變中檢出[6]。在本研究中,我們摸索通過(guò)小劑量AOM腹腔注射聯(lián)合3個(gè)周期的葡聚糖硫酸鈉(分子量36,000-50,000,濃度為3%-2%-2%)建立潰瘍性結(jié)腸炎癌變的動(dòng)物模型,并初步探索APC,β-catenin和P53在潰瘍性結(jié)腸炎相關(guān)性結(jié)腸癌發(fā)病機(jī)制中的作用,以此為研究人類潰瘍性結(jié)腸炎癌變的機(jī)制提供一定的提示線索。 研究目的：通過(guò)摸索建立潰瘍性結(jié)腸炎癌變的動(dòng)物模型,借助動(dòng)物模型,探究潰瘍性結(jié)腸炎癌變過(guò)程中的APC,β-catenin和P53的表達(dá)情況和K-ras基因第一外顯子第12密碼子的突變情況,初步探索人類潰瘍性結(jié)腸炎癌變的分子機(jī)制以及早期診斷的指標(biāo)。 方法與材料：我們選擇4-5周齡雄性C57BL小鼠,隨機(jī)分為四組：A組為建模組AOM+DSS組(20只),B組為DSS組(12只),C組為AOM組(12只),D組為空白對(duì)照組(12只)。于SPF級(jí)動(dòng)物房適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,A組腹腔注射AOM(10mg/Kg),一周后以3%DSS喂養(yǎng)5天,后休息16天,以上述過(guò)程為1個(gè)循環(huán),重復(fù)兩個(gè)循環(huán)(采用2%DSS),B組及C組分別只給予AOM腹腔注射或DSS喂養(yǎng),D組不予任何處理。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中每1-2天記錄小鼠體重、皮毛、精神狀態(tài)及排便情況,分別于每個(gè)循環(huán)末各組均處死4只小鼠,3個(gè)周期結(jié)束后處死全部小鼠(8只/組)。采用乙醚麻醉斷頸,分別取遠(yuǎn)端、近端結(jié)腸組織各一塊,若可見(jiàn)肉眼腫塊,取腫塊標(biāo)本固定,余下標(biāo)本凍存,顯微鏡下觀察不同時(shí)期組織病理變化,通過(guò)免疫組化的方法,采用兔抗人多克隆抗體：抗β-catenin抗體(Abcom),抗APC,抗P53抗體(Santa Cruz),研究APC, β-catenin,P53在各階段的結(jié)腸粘膜中的表達(dá)情況。同時(shí)采用天根的組織DNA提取試劑盒通過(guò)提取凍存組織DNA,進(jìn)行PCR擴(kuò)增目的片段,.送至公司測(cè)序的方法研究K-ras突變。 結(jié)果：1.動(dòng)物模型建立和分組將小鼠隨機(jī)分組,小劑量AOM(10mg/Kg)腹腔注射聯(lián)合3周期DSS(分子量36,000-50,000；第一周期3%,第二三周期為2%)喂養(yǎng),實(shí)驗(yàn)第6天AOM+DSS組及DSS組可出現(xiàn)血便或稀便,體重下降,14天后可基本恢復(fù)。第3周期結(jié)束,A組(AOM+DSS組)中5/8(62.5%)只小鼠結(jié)腸可見(jiàn)腫塊產(chǎn)生,多位于遠(yuǎn)段,其次為中段,前段未見(jiàn),余下各組均未見(jiàn)腫瘤產(chǎn)生。2.P53和β-catenin采用免疫組化方法檢測(cè)提示正常結(jié)腸粘膜中的表達(dá)兩者均為陰性；β-catenin在潰瘍性結(jié)腸炎相關(guān)性結(jié)腸癌,潰瘍性結(jié)腸炎組織的表達(dá)存在顯著性差異(P值0.029)；P53僅在第2周期結(jié)束不典型增生標(biāo)本中檢測(cè)到,腫瘤標(biāo)本中未檢測(cè)到P53核表達(dá)。3.APC蛋白在潰瘍性結(jié)腸炎及潰瘍性結(jié)腸炎相關(guān)結(jié)腸癌組織中未見(jiàn)明顯差異。4. K-ras突變檢測(cè)潰瘍性結(jié)腸炎相關(guān)結(jié)腸癌及潰瘍性結(jié)腸炎標(biāo)本中均未檢測(cè)到K-ras突變。 結(jié)論：1.小劑量致癌劑AOM (10mg/Kg)腹腔注射聯(lián)合致炎劑葡聚糖硫酸鈉DSS(分子量36,000-50,000)反復(fù)刺激可誘導(dǎo)C57BL小鼠結(jié)腸遠(yuǎn)段及中段產(chǎn)生腫瘤。2.β-catenin在潰瘍性結(jié)腸炎及潰瘍性結(jié)腸炎相關(guān)性結(jié)腸癌組織中表達(dá)具有顯著差異,提示潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)生癌變的機(jī)制可能與wnt信號(hào)途徑有關(guān)。3.P53突變可能是潰瘍性結(jié)腸炎癌變過(guò)程中的早期事件,在小鼠動(dòng)物模型的癌變機(jī)制可能與人類存在差異。4. K-ras途徑在潰瘍性結(jié)腸炎癌變過(guò)程中可能作用較弱。
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R-332;R574.62

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 高豐,張學(xué),宋今丹;Wnt途徑──調(diào)控細(xì)胞增殖和癌變的關(guān)鍵途徑[J];生命科學(xué);2001年01期

2 王冬飛;沈曉伶;王建國(guó);;二甲肼和葡聚糖硫酸鈉建立潰瘍性結(jié)腸炎相關(guān)性大腸癌小鼠模型[J];胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志;2006年05期

本文編號(hào)：2744759