【摘要】： 經(jīng)典理論認(rèn)為促性腺激素釋放激素(GnRH)是由下丘腦神經(jīng)元分泌的一種十肽激素，它經(jīng)下丘腦垂體門脈系統(tǒng)進(jìn)入垂體前葉，與垂體前葉的促性腺激素分泌細(xì)胞上的促性腺激素釋放激素受體(GnRHR)結(jié)合，刺激卵泡刺激素(FSH)和黃體生成素(LH)的分泌，進(jìn)而調(diào)節(jié)性腺的發(fā)育與配子的形成。近二十年的大量研究證據(jù)表明，GnRH及其受體廣泛存在于下丘腦-垂體軸之外，如生殖系統(tǒng)(卵巢、輸卵管、前列腺、睪丸以及胎盤等)、免疫系統(tǒng)(T、B淋巴細(xì)胞)和許多惡性腫瘤(如乳腺癌、肺癌、胰腺癌及肝癌)，通過自分泌和旁分泌途徑對這些組織器官以及惡性腫瘤的生長起調(diào)節(jié)作用。 我們先前的研究表明，在大鼠的消化系統(tǒng)廣泛地存在有GnRH及其受體，并且其受體的基因序列與垂體的基因序列一致，說明大鼠的消化系統(tǒng)能夠自身分泌與合成GnRH及其受體，同時(shí)這些組織或細(xì)胞是GnRH作用的靶細(xì)胞，如GnRH類似物可明顯促進(jìn)大鼠 第四軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文：大鼠胰腺促性腺激素釋放激素及其受體的研究 頜下腺神經(jīng)生長因子的分泌，還可明顯抑制大鼠胃酸的分泌。但 是大鼠胰腺是否存在GnRH及其受體，它們的基因序列如何，GnRH 對大鼠胰腺的功能有何影響，其受體的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制怎樣，這些 問題均未見報(bào)道。 由此我們在以往研究的基礎(chǔ)上。進(jìn)行了以下研究： 應(yīng)用兔疫組織化學(xué)和原位雜交技術(shù)在胰腺組織切片上檢測 GnRH及其受體的定位及表達(dá)； 利用反轉(zhuǎn)錄PCR和基因克隆測序的方法對大鼠胰腺GnRH及其 受體的基因序列進(jìn)行研究； 運(yùn)用組織塊體外孵育法，用不同濃度GnRH類似物進(jìn)行刺激， 同時(shí)借助ELISA、放免法等技術(shù)觀察在體外條件下GnRH對大鼠胰 腺內(nèi)、外分泌功能的影響； 借助活體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，由尾靜脈注射和十二指腸灌注兩種方式給 與GnRH類似物，留取血漿和十H指腸液，分別檢測胰腺內(nèi)、外分 泌功能指標(biāo)的變化； 原代培養(yǎng)大鼠胰腺腺泡細(xì)胞，體外條件下給予GnRH類似物刺 激，應(yīng)用細(xì)胞凋亡檢測試劑盒和流式細(xì)胞技術(shù)，觀察GnRH對大鼠 胰腺細(xì)胞凋亡的影響： 用ELISA、放免法、激光共聚焦技術(shù)和免疫組化染色技術(shù)等觀 察不同濃度GnRH類似物在不同時(shí)間內(nèi)對大鼠胰腺細(xì)胞胞內(nèi)cAMP、 MAPK、PKC、Ca卜、iNOS含量變化的影響。 通過實(shí)驗(yàn)得到主要研究結(jié)果如下： 應(yīng)用免疫組織化學(xué)和原位雜交的方法發(fā)現(xiàn)，胰腺的外分泌部 部分細(xì)胞含有GnRH免疫反應(yīng)陽性物質(zhì)，而胰島細(xì)胞未發(fā)現(xiàn)GnRH 免疫反應(yīng)陽性物質(zhì)。同時(shí)胰島內(nèi)所有胰高血糖素免疫反應(yīng)陽性的 4 第四軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文：大鼠胰腺促性腺激素釋放激素及其受體的研究 細(xì)胞均呈GnRH受體免疫反應(yīng)陽性，兩種陽性細(xì)胞的數(shù)量及分布特 點(diǎn)完全一致。原位雜交雜交結(jié)果顯示在胰腺內(nèi)、外分泌部均發(fā)現(xiàn) GnRHR覦NA雜交信號(hào)。結(jié)合以往研究發(fā)現(xiàn)胰腺外分泌部檢測到 GnRH mRNA雜交信號(hào)，我們認(rèn)為胰腺外分泌部細(xì)胞能夠分泌GnRH， 而其受體分布于胰腺內(nèi)、外分泌部大部分細(xì)胞。 我們從大鼠胰腺提取總RNA，應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄PCR的方法分別擴(kuò) 增GnRH和GnRHR基因，并對產(chǎn)物進(jìn)行純化回收，然后進(jìn)行序列分 析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大鼠胰腺GnRH基因序列與下丘腦的完全一致：而胰 腺GnRHR基因序列與垂體的完全一致。 應(yīng)用不同濃度的GnRH類似物進(jìn)行體外組織塊孵育，收集培養(yǎng) 上清液進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)，體外條件下，GnRH能明顯增加胰蛋白酶和 胰高血糖素的分泌，降低胰島素的分泌，并且具有明顯的濃度依 賴性。 體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中我們從尾靜脈和十二指腸兩種途徑給藥，結(jié) 果發(fā)現(xiàn)：尾靜脈給藥能明顯增加胰蛋白酶和胰高血糖素的分泌， 降低胰島素的分泌；十二指腸給藥僅能增加胰蛋白酶的分泌，對 胰島素和胰高血糖素的分泌均無影響。 最后我們對GnRHR的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)GnRH類 似物刺激胰腺細(xì)胞后，PKC活性的變化顯示明顯的時(shí)間和劑量依賴 性，其活性高峰出現(xiàn)在30min；cAMP水平變化里時(shí)間和劑量依賴 性，在個(gè)2小時(shí)含量變化最大，2小時(shí)達(dá)高峰：瞅瞅在短時(shí)間內(nèi) 即出現(xiàn)活性高峰，且其含量變化里劑量依賴性；i NOS的活性在整 個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中沒有出現(xiàn)明顯的變化；同時(shí)本實(shí)驗(yàn)觀察＊”變化曲 線時(shí)可以看到延遲峰（膜上鈣通道開放所致）和瞬時(shí)峰（胞內(nèi)鈣 庫開放所致）均存在，推測胞內(nèi)＊“水平的提高有胞內(nèi)和胞外兩 5 第四軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文：大鼠胰腺促性腺激素釋放激素及其受體的研究 種來源的＊”的參與，分別應(yīng)用膜上二型鈣通道阻滯劑Lac i di…ne 和胞內(nèi)鈣庫阻滯劑Ryanodine的實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明這一推測，即胞 內(nèi)C／“水平的提高既有通過膜上乙型鈣通道進(jìn)入胞漿的＊“也有 通過胞內(nèi)鈣庫釋放進(jìn)人跑漿的CaZ”的參與。由以上結(jié)果我們推測 大鼠胰腺GnRHR的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有叫C－Cd”途徑，同時(shí)還有cA慚、MAPK 的參與。 綜上所述，本研究首次在大鼠胰腺中發(fā)
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2003
【分類號(hào)】：R329
【圖文】：

純出一種哺乳類GnRH(mGnRH)以來，人們又陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了羊、大鼠、小鼠等哺乳類動(dòng)物的mGnRH，并且發(fā)現(xiàn)其在分子結(jié)構(gòu)上具有高度的保守性(圖1)。在King和Millar(1979)于非哺乳類脊椎動(dòng)物腦中發(fā)現(xiàn)新的GnRH分子類型以前，人們一直認(rèn)為GnRH的分子形式只有一種。在對非哺乳類脊椎動(dòng)物的研究中，人們陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了一些新的GnRH分子，它們長度相同，是由九種不同類型的氨基酸組成的十膚，含至少50%相同的氨基酸序列，結(jié)構(gòu)上它們的一COOH端和一NHZ端(第1，2，3

圖520一25Kb，GnRHR基因和轉(zhuǎn)錄單位結(jié)構(gòu)示意圖。GnRHR單拷貝基因長約由3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子構(gòu)成，各種屬間高源性較高。2.GnRHR的垂體外表達(dá)及調(diào)控研究表明，垂體組織中GnRHRmRNA的含量最高，其次為卵巢和翠丸，分別為40%和5%(Stojilkovie等，1994);近來人們采用RNA印記、RT一PCR、原位雜交和受體結(jié)合試驗(yàn)分析表明，在大鼠、牛、羊和人等哺乳類動(dòng)物的垂體中存在的GnRH自分泌調(diào)節(jié)機(jī)制。隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)除下丘腦一垂體軸系以外，GnR!1及其受體均可存在于其它組織器官中。在生殖系統(tǒng)，經(jīng)RT一PCR及克隆測序等研究發(fā)現(xiàn)，GnRH及其受體存在于卵巢上皮細(xì)胞(Kang等，、en，;atwan，

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 黃威權(quán)，向正華，孟琳;促性腺激素釋放激素mRNA陽性細(xì)胞在大鼠胃腸胰系統(tǒng)的分布[J];解剖學(xué)報(bào);1996年02期

本文編號(hào)：2716231