【摘要】： 近來(lái)的研究顯示，革蘭陰性菌中一種基因捕獲和表達(dá)的遺傳單位——整合子(integron)在細(xì)菌獲得抗生素抗性機(jī)制中起了重要作用。整合子由整合酶(integrase)基因(intl)、整合酶特異性重組點(diǎn)attI和數(shù)目不定的基因盒(gene cassette)組成�；蚝型梢粋�(gè)編碼抗生素抗性的開(kāi)放讀碼框(ORF)和一個(gè)整合位點(diǎn)attC組成�；蚝锌蓮恼献又星谐蔀橛坞x的環(huán)狀分子，或者將外源基因盒捕獲并整合入整合子。 近些年臨床上分離的志賀菌對(duì)以往臨床常用的抗生素逐漸耐藥，有的菌株甚至多重耐藥。以往研究表明，結(jié)合性質(zhì)粒在志賀菌耐藥性形成起了重要作用。新近數(shù)起研究報(bào)道了志賀菌中Ⅰ類和Ⅱ類整合子與菌株耐菌性關(guān)系。本研究對(duì)杭州地區(qū)近年分離的福氏和宋內(nèi)氏志賀菌株進(jìn)行Ⅰ類和Ⅱ類整合子的檢測(cè)，了解其分布特征；進(jìn)一步通過(guò)克隆測(cè)序和Southenblot，確定其攜帶的基因盒組成特征以及其在基因組中的位置；在研究中發(fā)現(xiàn)了一種缺少3’保守區(qū)的非典型Ⅰ類整合子，通過(guò)反轉(zhuǎn)PCR了解此整合子的切除基因盒的特征；并對(duì)非典型Ⅰ類整合子和Ⅱ類整合子各自攜帶的aadA賦予宿主菌鏈霉素抗性的不同能力，進(jìn)行了探討。 本研究的64株宋內(nèi)和福氏志賀菌中，63株分別于1998至2002年分離自杭州地區(qū)散發(fā)腹瀉病人、暴發(fā)病人，1株分離自一起暴發(fā)事件的水源。 1．典型Ⅰ類整合子的分布及一級(jí)結(jié)構(gòu)特征 典型的Ⅰ類整合子包括有5’保守片段(intI1)、可變基因盒區(qū)(引物inF～inB)和3’保守片段(引物qacEΔ1～sul1)。本文64株福氏和宋內(nèi)志賀菌株中，三者均陽(yáng)性 浙江大學(xué)博士學(xué)位論文 的菌株僅有6株，陽(yáng)性率為9.4%。對(duì)其可變區(qū)測(cè)序分析，其中2株宋內(nèi)志賀菌I 類整合子均攜帶1個(gè)基因盒，為氨基糖昔腺營(yíng)酞基轉(zhuǎn)移酶(aminoglycoside adenylyltransferase)AZ基因(aa朔2)，編碼對(duì)鏈霉素的抗性。另2株宋內(nèi)志賀菌I類 整合子攜帶2個(gè)基因盒，分別緊鄰5’保守區(qū)依次為二氫葉酸還原酶(dihydrofolate reductase) Al型基因(咖月I)和氨基糖昔腺普酞基轉(zhuǎn)移酶Ala基因是(a adAla)，以及 二氫葉酸還原酶A17型基因(動(dòng)討I乃和氨基糖昔腺昔酞基轉(zhuǎn)移酶Ala基因(aa咖習(xí)。 1株福氏志賀菌y變種攜帶的基因盒類型與其中一株宋內(nèi)志賀菌相同，為護(hù)漢17和 aad減萬(wàn)。1株福氏6型志賀菌攜帶一個(gè)dfrV基因盒。分別提取2株攜帶典型I類整 合子的宋內(nèi)志賀菌株基因組DNA和質(zhì)粒DNA(其中基因組DNA經(jīng)B“mHI和Pst I限制酶切)，瓊脂糖凝膠電泳后，intll探針Southenblot結(jié)果顯示典型整合子是位 于質(zhì)粒上的。 2.非典型I類整合子的分布及一級(jí)結(jié)構(gòu)特征 在檢測(cè)典型I類整合子過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)了30株intll陽(yáng)性，但可變區(qū)陰性、3’ 保守區(qū)陽(yáng)性僅有3株(陽(yáng)性率為5.1%)，推測(cè)福氏志賀菌株中可能廣泛存在著某種 非典型I類整合子。選擇此類菌株分別提取基因組DNA和質(zhì)粒DNA(其中基因組 DNA經(jīng)BamHI和Pstl限制酶切)，瓊脂糖凝膠電泳后，intll探針SOuthenblot結(jié) 果顯示提示此intll是位于細(xì)菌染色體上的。將其中CIOI一1株基因組DNA中intll 陽(yáng)性的BamHI和Pstl限制酶切段(3 .4 kb)克隆至載體pUC19上(此質(zhì)粒稱為 puc一C101)，并進(jìn)行核酸序列測(cè)定。序列分析表明此插入片段依次由intll基因、 attl位點(diǎn)以及blaoxA_30和aadAI基因盒組成，典型I類整合子3’保守區(qū)部分被一 段插入序列151所替代。2個(gè)ORF分別編碼p內(nèi)酞胺酶OXA一30和氨基糖普腺昔 酞基轉(zhuǎn)移酶Al。 應(yīng)用擴(kuò)增此型基因盒區(qū)的引物intl Ica一F和引物15 Ica一R，對(duì)本文所有菌株進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，結(jié)果30株intll陽(yáng)性的無(wú)典型I類整合子的志賀菌株中(1株宋內(nèi)志賀 菌，29株福氏志賀菌)，29株擴(kuò)增出相同長(zhǎng)度的PCR產(chǎn)物，而6株攜帶典型I類 整合子的志賀菌和其余28株intll陰性的志賀菌均未擴(kuò)增出陽(yáng)性條帶(見(jiàn)表l)。結(jié) 果表明，此29株intll陽(yáng)性志賀菌株有著相同的基因盒區(qū)，我們將之稱為志賀菌非 典型I類整合子(intll和intH一151同時(shí)陽(yáng)性);福氏志賀菌中此非典型I類整合子總 浙江大學(xué)博士學(xué)位論文 檢出率高達(dá)84.8%(28/33)，尤其是福氏2a和2b中均為100%(13/13和9/9):宋內(nèi) 志賀菌中則較低，為3.2%(l/31)。非典型I類整合子陽(yáng)性菌株中氨節(jié)青霉素抗性的 陽(yáng)性率分別為100%(21/2l)，而其他非典型I類播合子陰性菌株中為51.9%(14/27)。 3.非典型I類整合子的基因盒切除模式 我們使用反轉(zhuǎn)PcR在攜有pUC一c101的大腸埃希菌過(guò)夜培養(yǎng)肉湯煮沸物中檢 測(cè)到了游離基因盒的存在，并發(fā)現(xiàn)了aadAI基因盒與blaoxA-30基因盒連鎖的切除 模式。結(jié)果表明，此非典型I類整合子是功能性的。 4.H類整合子分布及其一級(jí)結(jié)構(gòu)特征 通過(guò)檢測(cè)n類整合子intIZ基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)H類整合子在宋內(nèi)和福氏志賀菌中 分布廣泛，陽(yáng)性率分別達(dá)80.6%(25/31)和87.9%(29/33)。進(jìn)一步研究表明11類整合 子是位于染色體上的。 提取intIZ陽(yáng)性的宋內(nèi)志賀菌C202株的基因組DNA，將一條含intIZ的去斤”d m限制酶切段(10.7 kb)克隆至載體pUC19上(此
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2004
【分類號(hào)】：R378.25
【圖文】：

的菌株僅有6株，陽(yáng)性率為9.4%;其中宋內(nèi)志賀菌4株、福氏志賀菌6型1株及福氏志賀菌y變種1株(表1、表3)。此6株菌典型I類整合子可變基因盒區(qū)的PCR擴(kuò)增圖譜見(jiàn)圖5。對(duì)其可變區(qū)擴(kuò)增產(chǎn)物核酸序列分析表明，共有4種基因盒類型，模式圖見(jiàn)圖3A，序列詳見(jiàn)圖6。其中2株宋內(nèi)志賀菌(C103一1株和yhOZ一25株)I類整合子均攜帶1個(gè)基因盒，為氨基糖昔腺昔酞基轉(zhuǎn)移酶(aminoglyeosideadenylyltransferase)AZ基因(aa“2)(見(jiàn)圖3A、表3)，編碼對(duì)鏈霉素的抗性;但此2株菌株(C103一1株和yhoZ一25株)對(duì)鏈霉素的紙片法藥敏試驗(yàn)結(jié)果均為敏感(表3)。另2株宋內(nèi)志賀菌(外02一26株和yh31株)I類整合子攜帶2個(gè)基因盒，yh02一26株中緊鄰5’保守區(qū)依次為二氫葉酸還原酶(diliydrofolatereductase)Al型基因(護(hù)月!)和氨基糖普腺昔酞基轉(zhuǎn)移酶Ala基因是(aa喇Ia)(見(jiàn)圖3A、表3)，分別編碼對(duì)三甲氧節(jié)二氨啼睫(trimethoprim

分別提取攜帶典型I類整合子的宋內(nèi)志賀菌株Clo3一1株和yhOZ一26株基因組DNA和質(zhì)粒DNA(其中基因組DNA經(jīng)B“mHI和Pstl限制酶切)，瓊脂糖凝膠電泳后，intll探針Southenblot結(jié)果顯示(圖7中的第7和第8泳道)，二者在基因組DNA和質(zhì)粒DNA中均有陽(yáng)性條帶出現(xiàn)，因提取的基因組DNA中包含有質(zhì)粒DNA，此結(jié)果提示志賀菌C103一1株和yh02一26株中的典型整合子是位于質(zhì)粒上的。圖7志賀菌株基因組DNA和質(zhì)粒DNA的intllsouthenbot結(jié)果A:基因組DNABamHI和Pstl酶切后的凝膠電脈圖譜B:質(zhì)粒DNA的凝膠電脈圖譜C:基因組DNABamHI和Pstl酶切后的intl]Southenbot結(jié)果D:質(zhì)粒DNA的intl!Southenbot結(jié)果Lanel一12:依次為宋內(nèi)志賀菌株e202(intll陰性)、C199一2(intl!陽(yáng)性)和108(intll陰性)、福氏Za志賀菌株C17s一l(int，l陽(yáng)性)和elol一l(int，l陽(yáng)性)、福氏Zb志賀菌株yh02一29(intll陽(yáng)性)、攜帶典型I類整合子宋內(nèi)志賀株Clo3一1和yh02一26、intll陰性的宋內(nèi)志賀菌株yhoZ一加和yhoZ一21、intll陰性的福氏2a型志賀菌株301和攜帶有pUC一C202的大腸埃希菌DHSQ。LaneM:Marker(人DNAHindlll)。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 黃良竹,黃玉紅;913株小兒福氏志賀菌的藥敏分析及耐藥變遷[J];海峽藥學(xué);2000年03期

本文編號(hào)：2713660