【摘要】： 在20世紀(jì)70年代以前，人們認(rèn)為細(xì)胞膜的脂質(zhì)成分只是一類生化惰性的結(jié)構(gòu)材料。那時(shí)，也有部分報(bào)道認(rèn)為脂質(zhì)成分很可能是重要的信號(hào)分子。磷酸肌醇循環(huán)的發(fā)現(xiàn)以里程碑的形式證明了脂質(zhì)在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中發(fā)揮重要作用。在磷脂酶C作用下，磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）發(fā)生水解，從其脂質(zhì)骨架中釋放出頭部基團(tuán)1,4,5-三磷酸肌醇（IP3）和甘油二酯（DAG），IP3作用于胞內(nèi)膜受體，動(dòng)員細(xì)胞內(nèi)儲(chǔ)存Ca2+，而DAG直接結(jié)合并且活化蛋白激酶C（PKC），啟動(dòng)各自的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。 隨后又發(fā)現(xiàn)，在磷脂酶A2作用下生成的花生四稀酸和磷脂，也是重要的脂類第二信使和細(xì)胞內(nèi)效應(yīng)調(diào)節(jié)劑�；ㄉ南∷嶙鳛橐环N前體物質(zhì)，生成多種衍生物，每種衍生物都有其特異性的漿膜或細(xì)胞內(nèi)受體，從而引導(dǎo)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)方向，產(chǎn)生特異性細(xì)胞反應(yīng)。 其它的脂質(zhì)信號(hào)分子還包括磷脂酸（磷脂酶D代謝產(chǎn)物）、溶血磷脂酸、血小板活化因子（PAF）和3,4,5-三磷酸磷脂酰肌醇（PIP3，磷脂酰肌醇-3-激酶的代謝產(chǎn)物），具有激活A(yù)kt/PKB、PDK、PKC-ε和PKC-ζ的作用。 近年來，又發(fā)現(xiàn)膜脂質(zhì)的另一種組分—鞘脂類也是重要的信號(hào)分子。鞘脂類信號(hào)分子是鞘脂長鏈基團(tuán)衍生物，種類繁多、結(jié)構(gòu)復(fù)雜。哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面的糖脂成分，就是糖鏈基團(tuán)接合膜鞘脂組成的。 德國人Tudichum首先采用分散結(jié)晶的方法，從腦組織的乙醇提取物中分離出一種天然成分，其分子結(jié)構(gòu)由糖基、脂肪酸和有機(jī)質(zhì)基團(tuán)三部分組成，并將此種物質(zhì)命名為‘sphingosine'（鞘氨醇），取詞于‘Sphinx’（希臘神話中的獅身人面像）來形容這種物質(zhì)具有神秘的分子結(jié)構(gòu)。 目前，已經(jīng)鑒定了300余種鞘脂類物質(zhì)，對(duì)其功能、代謝及降解缺陷性疾病進(jìn)行了詳細(xì)的探索。特別是Yasuf.A Hannun發(fā)現(xiàn)鞘氨醇 WP=5 （鞘脂類代謝產(chǎn)物）具有抑制PKC功能后，鞘脂類作為生物活性分子的認(rèn)識(shí)激發(fā)了人們極大的興趣。除了鞘脂信號(hào)過程及代謝途徑外，人們還對(duì)相關(guān)的酶學(xué)，拓?fù)鋵W(xué)（指細(xì)胞內(nèi)功能定位）及病理生物化學(xué)等內(nèi)容進(jìn)行了深入研究。 鞘脂代謝物中具有明確生物活性的分子包括鞘氨醇、神經(jīng)酰胺和1-磷酸鞘氨醇；此外，鞘糖基磷酸膽堿、鞘氨醇半乳糖苷、乳糖基�；拾贝己湍X苷脂可能也有生物活性。 由于神經(jīng)酰胺在涉及細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)、衰老及凋亡等多種關(guān)鍵生物學(xué)行為的信號(hào)通路的調(diào)節(jié)方面具有重要作用，因此近十年來對(duì)神經(jīng)酰胺的代謝和功能進(jìn)行了深入研究。 神經(jīng)酰胺酶(Ceramidase, CDase)是參與神經(jīng)酰胺降解反應(yīng)的關(guān)鍵酶類。它催化神經(jīng)酰胺水解，生成鞘氨醇，與神經(jīng)鞘磷脂酶（Sphingomyelinase, SMase）一起調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)酰胺的水平。根據(jù)其作用的最適PH值不同，分為酸性、堿性和中性神經(jīng)酰胺酶。在鞘氨醇激酶（分布于胞漿）的作用下，鞘氨醇迅速代謝為1-磷酸鞘氨醇（SPP）�，F(xiàn)在認(rèn)為，SPP也是一種胞內(nèi)第二信使，具有動(dòng)員細(xì)胞內(nèi)儲(chǔ)存Ca2+、促進(jìn)細(xì)胞增殖及抑制細(xì)胞凋亡等多種作用。 目的：最近，又克隆了一種新的神經(jīng)酰胺酶 (El Bawab S et al. JBC 2000; 275:21508-13)，選擇性定位于線粒體。提示線粒體存在著神經(jīng)酰胺代謝途徑，可能對(duì)線粒體的功能特別是抗凋亡功能產(chǎn)生影響。我們將線粒體神經(jīng)酰胺酶基因轉(zhuǎn)染到K562細(xì)胞，以此了解線粒體神經(jīng)酰胺酶細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)。 方法：1 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 人類慢性粒細(xì)胞白血病急變期細(xì)胞株K562，培養(yǎng)于含體積分?jǐn)?shù)為10%的滅活胎牛血清（FBS）、100U/ml的青霉素和100μg/ml硫酸鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液中，置37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的二氧化碳的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3天傳代一次，實(shí)驗(yàn)用對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，臺(tái)盼藍(lán)染色拒染率均在95%以上。 含有線粒體神經(jīng)酰胺酶cDNA序列的pCDNA3.1/His-CDase質(zhì)粒由美國南卡羅來那醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)部Yusuf.A.Hannun教授惠贈(zèng)。取對(duì)數(shù)生長期的K562細(xì)胞，以無血清的RPMI1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為2×10~6/ml，取0.5ml接種于6孔平 WP=6 底培養(yǎng)板，加入pCDNA3.1/His-CDase質(zhì)粒3μg、TfxTM-50脂質(zhì)體13.5μl及37℃無血清RPMI1640 振蕩混勻的乳濁液0.5ml，37℃孵育1h，加入5ml RPMI1640完全培養(yǎng)液（37℃），孵育48h。吸取細(xì)胞懸液置25cm2培養(yǎng)瓶（costar）中培養(yǎng)，加入終濃度為800μg/ml的G418篩選轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的陽性細(xì)胞株，每3天換液一次，3周后篩選出具有G418抗性的K562細(xì)胞，命名為“K562TC”。 2 RT-PCR檢測(cè)神經(jīng)酰胺酶（CDase）mRNA表達(dá)水平 分別離心收集K562TC及K562細(xì)胞，以Trizol RNA提取試劑盒提取細(xì)胞總RNA，以M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。CDase擴(kuò)增條件：94℃ 40s，53℃ 40s，72℃ 1min，擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)。β2M擴(kuò)增條件：94℃ 40s，55℃ 40s，72℃ 1min，擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)。CDase正義引物5’TCACCAGTGGGACCATTGAA3’，CDase反義引物5’CCATGATGAAGGCACGACTG 3’,擴(kuò)增片段為337bp。β2M正義引物5’ACCCCCACTGAAAAAGATGA3’，β2M反義引物5’ATCTTCAAACCTCCATGATG3’，擴(kuò)增片段為115bp。取擴(kuò)增產(chǎn)物，經(jīng)1.8%的瓊脂糖凝膠電泳、EB 染色，紫外燈下觀察結(jié)果，讀膠儀（AlphaImageTM 1220 Documentation Analysis System, Alpha Innotec Corperation , USA）掃描讀取各條產(chǎn)物帶的光密度值，以CDase/β2M的比值作為CDase的相對(duì)表達(dá)
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2003
【分類號(hào)】：R341
【圖文】：

以神經(jīng)酰胺為中心的鞘磷脂代謝途徑

鞘磷脂代謝的細(xì)胞定位

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 季紅斌,翟琦巍,劉新垣,鄭仲承;bcl-2基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控[J];生物化學(xué)與生物物理學(xué)報(bào);2000年02期

本文編號(hào)：2713372