【摘要】：第一部分Hsa-miR-34a靶基因的生物信息學(xué)預(yù)測及分析 目的:為了估測和評價miR-34a的目的靶基因，我們通過在線生物信息網(wǎng)站，采用生物信息技術(shù)和計算機技術(shù)，從而獲得hsa-miR-34a參與的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機制的信息。方法：以hsa-miR-34a作為檢索詞在miRGen數(shù)據(jù)庫搜索，調(diào)取miRanda，PicTar及TargetScanS三種在線軟件預(yù)測的交集，選出與細胞增殖密切相關(guān)的基因。結(jié)果：通過GO注釋軟件得到8個與腫瘤增殖相關(guān)的基因。NOTCH1參與細胞增殖等重要生理活動并且起了關(guān)鍵作用，因此我們分析可能的靶基因NOTCH1,發(fā)現(xiàn)NOTCH1基因的3′UTR段與miR-34a的有不完全互補序列，且在多物種有高度的保守性及較低的結(jié)合自由能。結(jié)論: miR-34a可能參與的多個目的靶基因的調(diào)控，NOTCH1很可能是miR-34a的一個靶基因。 第二部分miR-34a靶向調(diào)控NOTCH1基因?qū)W480細胞增殖的影響 目的:探討miR-34a靶向調(diào)控Notch1基因表達而對結(jié)腸癌SW480細胞增殖的影響。方法:通過生物信息學(xué)預(yù)測，Notch1為miR-34a特 異性靶基因。構(gòu)建含miR-34a結(jié)合位點的Notch1基因3'-UTR域熒光 素酶報告載體。通過熒光素酶報告載體系統(tǒng)檢測miR-34a與Notch1的3'-UTR相互作用對熒光素酶活性的影響；免疫印跡技術(shù)檢測miR-34a對Notch1蛋白表達的影響。采用MTT法及流式細胞檢測轉(zhuǎn)染miR-34a對SW480細胞增殖的影響。結(jié)果:經(jīng)過酶切及基因測序鑒定，Notch1基因3'-UTR序列的雙熒光素酶報告重組質(zhì)粒構(gòu)建成功；并且miR-34a與Notch1的3'-UTR位點相結(jié)合。免疫印跡結(jié)果提示miR-34a負性調(diào)控Notch1蛋白的表達。miR-34a過表達后能抑制SW480細胞增殖。結(jié)論: miR-34a負性靶向調(diào)控Notch1基因的表達而抑制SW480細胞的增殖。 第三部分miR-34a靶向調(diào)控NOTCH1基因抑制腸癌SW480細胞增殖的分子機制研究 目的：探討miR-34a靶向調(diào)控NOTCH1基因抑制SW480細胞增殖的分子機制。方法:SW480細胞分別使用NOTCH1基因的干擾質(zhì)粒si(pLenti6-NOTCH1-shRNA)及對照（si-nc）進行轉(zhuǎn)染；NOTCH1的表達質(zhì)粒（pNL-NICD）和對照（nc）分別轉(zhuǎn)染SW480-miR-34a細胞。Westernblot分別檢測NOTCH1的干擾組和過表達組中NOTCH1及p53蛋白的表達水平。結(jié)果:相對于SW480組而言，pLenti6-NOTCH1-shRNA組能顯 著地抑制NOTCH1基因的表達，其抑制率為43.94%(p=0.000)，而相應(yīng) 的p53蛋白表達增加了82%(p=0.040)。而pLenti6組的NOTCH1與p53蛋白表達無明顯差異。相對于SW480-miR-34a組而言，pNL-NICD組明顯地增加NOTCH1基因的表達，其上升率為60.5%(p=0.000)，而相應(yīng)的p53蛋白表達下降了48.1%(p=0.035)。而pNL組的NOTCH1與p53蛋白表達無明顯差異。結(jié)論：miR-34a對SW480細胞的生長的抑制作用至少部分是通過靶向調(diào)控NOTCH1的表達，上調(diào)p53蛋白的表達水平實現(xiàn)的。 第四部分miR-34a對大腸癌SW480細胞在裸鼠移植瘤生長的影響 目的：探討miR-34a對大腸癌SW480細胞對裸鼠移植瘤生長的影響及其分子機制。方法：在BALB/c鼠腋部皮下分別接種W480細胞、SW480-miR-34a細胞及SW480-control細胞，觀察各組裸鼠的成瘤情況，通過測量腫瘤長短徑來繪制生長曲線；通過測量移植瘤的重量計算抑瘤率。用HE染色觀察各組瘤組織的形態(tài)學(xué)改變；用免疫組化法及免疫印跡法檢測各組瘤組織中NOTCH1和P53的表達情況。結(jié)果:相對于種植SW480細胞組的裸鼠而言,種植SW480-miR-34a細胞組的裸鼠的成瘤速度明顯減慢，且瘤體重量明顯減少（F=1598,P 0.01），抑瘤率為73.60％，與種植SW480-control細胞組在成瘤速度和移植瘤的重量之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（F=2.635,P=0.821）。HE染色顯示：SW480-miR-34a細胞組的移植瘤的腫瘤細胞體積，核漿比例及核分裂相所占比例比SW480組和SW480-contrl組均明顯縮小。免疫印跡及免疫組化顯示：SW480-miR-34a細胞組的移植瘤中的NOTCH1的蛋白表達比SW480細胞組明顯降低（P＜0.01），兩者之間的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。而SW480-control細胞組的NOTCH1蛋白表達與SW480組之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論：miR-34a可以下調(diào)NOTCH1蛋白的表達來抑制結(jié)腸癌SW480細胞在裸鼠體內(nèi)的生長。
【圖文】：

1: Hsa miR 34a 與NOTCH1 3′ UTR 結(jié)合位點 ig 1: Binding sites for miR 34a and Notch1 3′ UTR bs 2:在多種脊椎動物的 NOTCH1 3′UTR 種子序列具有保守性.包括人類，大鼠，小鼠，兔，。白框代表保守序列。ig 2: Seed sequences of NOTCH1 3'UTR are conserved in vertebrate.including of human,ouse, mice, rat and canis.Wite rectangle was shown as the binding site

圖 2:在多種脊椎動物的 NOTCH1 3′UTR 種子序列具有保守性.包括人類，大鼠，小鼠，兔，犬。白框代表保守序列。Fig 2: Seed sequences of NOTCH1 3'UTR are conserved in vertebrate.including of human,mouse, mice, rat and canis.Wite rectangle was shown as the binding site3 討論microRNA(簡稱 miRNA)是一類由 18～24 堿基所組成的非編碼單鏈的小分子RNA[9]。目前研究表明，miRNA 能夠通過負向調(diào)控目的靶基因蛋白的表達，從而引起下游基因的表達的變化從而引起生物過程的發(fā)生變化。其主要機制是 miRNA 與靶基因 mRNA 的特異互補位點完全結(jié)合或不完全結(jié)合而導(dǎo)致目的靶 mRNA 的降解，從而在轉(zhuǎn)錄后水平或翻譯水平抑制基因的表達[10,11]。大量研究顯示 miRNA 參與了包括細胞分裂增殖、分化與發(fā)育以及代謝等許多重要的生物學(xué)過程[12-15]。目前研究miRNA 目的靶基因的方法主要包括實驗途徑[16,17]和生物信息學(xué)[18,19]途徑，只有將兩種途徑有效結(jié)合，才能準確地發(fā)現(xiàn) miRNA 的目的靶基因[20,21]。正是由于大部分的
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R735.3;R3411

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 邵新宏;于游;張才全;;miR-34a靶向調(diào)控NOTCH1基因?qū)W480細胞增殖的影響[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報;2012年22期

2 景黎君;賈永林;魯晶晶;韓瑞;王舒陽;李盡義;彭濤;賈延R，

本文編號：2711705