【摘要】： 血小板血栓形成是血管閉塞性疾病的主要成因。其表面的糖蛋 白Ⅱb/Ⅲa是血小板聚集最終共同途徑的關(guān)鍵要素。阻斷GPⅡb/Ⅲa 與纖維蛋白原的結(jié)合，能高效地抑制血小板的聚集，進(jìn)而使血小板血 栓不能形成。SZ-21是我室制備的一株針對(duì)GPⅢa的單克隆抗體，經(jīng) 家兔頸動(dòng)—靜脈血栓模型證實(shí)能顯著降低血栓形成，顯示了在抗血栓 治療中的潛在價(jià)值。為降低鼠源性單抗免疫原性（HAMA）及全抗體Fc 段對(duì)血小板的破壞，本研究將SZ-21制備成小分子抗體，并對(duì)這一抗 體片段進(jìn)行了純化、復(fù)性和體外性質(zhì)的研究。 一 SZ-21單克隆抗體可變區(qū)基因的克隆和序列分析 采用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）技術(shù)，從分泌抗血小板膜 糖蛋白Ⅲa單克隆抗體SZ-21雜交瘤細(xì)胞中克隆了該抗體的重、輕鏈 可變區(qū)（V區(qū)）基因，，并測(cè)序分析。SZ-21重鏈（V_H）基因全長(zhǎng)為342 bp， 輕鏈（V_L）基因全長(zhǎng)為306 bp，分別編碼114和102個(gè)氨基酸�；蛐� 列登錄號(hào)為VH：AF354053，VL：AF354054。 二 SZ-21單鏈抗體（SZ-21ScFv）基因的篩選和表達(dá) 為最大限度地保留單鏈抗體的血小板結(jié)合活性，利用噬菌體展示 技術(shù)進(jìn)行了高親和力篩選。將SZ-21 V_H和V_L基因分別與含有 （Gly_4Ser）_3多肽接頭的載體pSW1-ScFv連接，構(gòu)建成單鏈抗體基因 pSW1-SZ21ScFv，克隆到噬菌體分泌型表達(dá)載體pHEN1中。同時(shí)親 和層析純化血小板膜糖蛋白Ⅲa，用糖蛋白Ⅲa作為抗原進(jìn)行高親和力 篩選。經(jīng)過(guò)四輪“吸附—洗脫—擴(kuò)增”的富集過(guò)程，phage-ELISA 得到一個(gè)具有與血小板高親和力的克隆，轉(zhuǎn)化E.coli HB2151，表達(dá) 了可溶性ScFv融合蛋白。ELISA和Western blot證實(shí)該融合蛋白保 留了親本抗體的血小板結(jié)合特性。 三 SZ-21單鏈抗體高效表達(dá)載體的構(gòu)建及其在大腸桿菌中的融合表達(dá) 將上述篩選得到的單鏈抗體基因亞克隆到大腸桿菌融合型表達(dá)載 體pET20b中，得到pET20b-21ScFv。通過(guò)IPTG誘導(dǎo)在大腸桿菌E coli 抗血小板膜糖蛋白基因工程抗體的制備和性質(zhì)研究 摘 要 BLZI（DE3）PlysS中表達(dá)了功能分子。SDS－PAGE和 Western blot顯 示表達(dá)產(chǎn)物的分子量為27000。該融合蛋白除少量為分泌型表達(dá)外， 主要以包涵體形式存在，表達(dá)量占菌體總蛋白的 21％，約 20 m叭。同 時(shí)探索了該抗體片段的最佳復(fù)性條件。把包涵體形式表達(dá)的 SZ上 單 鏈抗體片段用尿素溶解，經(jīng)過(guò)蛋白質(zhì)的體外重折疊復(fù)性過(guò)程，成功地 得到具有活性的單鏈抗體片段。ELISA和Western印跡檢測(cè)證實(shí)，該 魚(yú)鏈抗體保留了與血小板特異結(jié)合的能力。 四SZ毛 的純化和體外性質(zhì)研究 通過(guò)NINTA樹(shù)脂親和吸附純化，獲得具有活性的高純度單鏈抗 體片段，純度達(dá)95％以上。流式細(xì)胞儀檢測(cè)證實(shí)該單鏈抗體能與人臍 靜脈內(nèi)皮細(xì)胞和血小板反應(yīng)。體外實(shí)驗(yàn)表明，SZ2 單鏈抗體能夠抑 制 ADP誘導(dǎo)的血小板聚集，其抑制能力呈劑量依賴性，其 IC刃為 12 ug／mL，在濃度為20 ug／mL時(shí)達(dá)到最大抑制率。對(duì)花生四稀酸誘導(dǎo)的 血小板聚集亦有相似的抑制作用。此外，SZ上 單鏈抗體同樣能夠抑 制纖維蛋白原與血小板的結(jié)合，顯示了其抗血栓作用。 以上結(jié)果表明，制備的基因工程抗體具有原鼠單克隆抗體的抗 血栓形成能力，減少了全抗體的人抗鼠抗體反應(yīng)（HAMAh 同時(shí)該小 分子抗體片段去除了抗體的FC段，避免鼠源性單克隆抗體引起血小 板嚴(yán)重下降的副作用。該單鏈抗體有望用于抗血栓治療。 五抗血小板膜糟蛋白單抗SZ毛 嵌合Fab片段基因構(gòu)建和表達(dá)研究 利用基因克隆技術(shù)，從雜交瘤細(xì)胞系 SZ上 中克隆出輕、重鏈可 變區(qū)基因，然后亞克隆到含有人恒區(qū)基因C＊和C。的質(zhì)粒pSWIFab 中，構(gòu)建成人一鼠嵌合Fab抗體片段質(zhì)粒pSZ2，在大腸桿菌中表 達(dá)了可溶性＊b抗體片段。SDS－PAGE顯示在分子量（Mr）45 000處 有一誘導(dǎo)條帶，與該嵌合抗體的理論計(jì)算值相符。表達(dá)量約為 800 fig／L， ELISA和Western檢測(cè)證實(shí)表達(dá)產(chǎn)物具有與血小板結(jié)合的活性。
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2001
【分類號(hào)】：R392-33

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前5條

1 楊嘉樹(shù),蔣朋宸,茹炳根;一種導(dǎo)向性溶栓劑的基因構(gòu)建及其在大腸桿菌中的表達(dá)[J];北京大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);1999年04期

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本文編號(hào)：2706953