【摘要】：目的： 1.建立大鼠海水浸泡脊髓開(kāi)放性損傷的動(dòng)物模型，觀察海水浸泡對(duì)脊髓開(kāi)放性損傷大鼠早期神經(jīng)功能及脊髓病理改變的影響，以評(píng)價(jià)模型的可靠性。 2.通過(guò)觀察大鼠運(yùn)動(dòng)功能及運(yùn)動(dòng)誘發(fā)電位（MEP）的長(zhǎng)期變化以及脊髓血流在一段時(shí)間內(nèi)的改變，研究海水浸泡對(duì)脊髓開(kāi)放性損傷大鼠脊髓功能的長(zhǎng)期影響和對(duì)脊髓局部血流變化的作用，探討早期應(yīng)用Lipo PGE1靜脈注射治療對(duì)神經(jīng)功能及脊髓血流的保護(hù)和改善作用。 3.通過(guò)對(duì)傷段脊髓標(biāo)本神經(jīng)細(xì)胞凋亡指數(shù)以及凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax表達(dá)情況的測(cè)定，研究海水浸泡對(duì)脊髓損傷后神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響及其機(jī)制，探討早期應(yīng)用Lipo PGE1靜脈注射治療的抗凋亡作用。 方法： 1.第一部分實(shí)驗(yàn)成年健康雄性SD大鼠隨機(jī)分為A組(假手術(shù)組)、B組（脊髓開(kāi)放性損傷組）、C組（脊髓開(kāi)放性損傷+生理鹽水浸泡30min組）、D組（脊髓開(kāi)放性損傷+生理鹽水浸泡60min組）、E組（脊髓開(kāi)放性損傷+海水浸泡30min組）和F組（脊髓開(kāi)放性損傷+海水浸泡60min組）共六組。采用改良Allen’s重物墜落打擊的方法造成大鼠SCI，各組分別于實(shí)驗(yàn)前及干預(yù)后3h、6h、12h、24h、72h六個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行神經(jīng)功能（BBB運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分、Rivlin斜板試驗(yàn)）檢測(cè)，并取傷段脊髓標(biāo)本大體及HE染色顯微鏡下觀察組織形態(tài)及病理學(xué)變化。 2.第二部分實(shí)驗(yàn)SD大鼠隨機(jī)分為Sham組、SCI組、海水浸泡（SW）組及LipoPGE1組共四組。各組分別于術(shù)前、24h、72h、1w、2w、4w、8w七個(gè)時(shí)間點(diǎn)采用BBB評(píng)分、Rivlin斜板試驗(yàn)比較各組行為學(xué)之間差異；于損傷前、浸泡后0h、24h、72h、1w、2w、4w、8w進(jìn)行MEP檢測(cè)，觀察潛伏期和波幅變化情況；于損傷前、損傷后0h、浸泡后0h、1h、2h、3h、6h、12h、24h、72h利用激光散斑襯比成像（LASCI）系統(tǒng)觀察脊髓背側(cè)血管血流變化情況。 3.第三部分實(shí)驗(yàn)SD大鼠依舊隨機(jī)分為Sham組、SCI組、SW組及Lipo PGE1組共四組。分別于干預(yù)后3h、6h、12h、24h、72h、1w六個(gè)時(shí)間點(diǎn)用TUNEL法檢測(cè)脊髓神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況，免疫組化SABC法檢測(cè)Bc1-2、Bax蛋白的表達(dá)。 結(jié)果： 1. SCI后各組大鼠BBB評(píng)分和Rivlin斜板試驗(yàn)功能角度值均顯著下降，在72h之前各時(shí)間點(diǎn)E、F組與B、C、D組相比并未見(jiàn)明顯差異，然而，在72h時(shí)間點(diǎn)，E、F組已明顯低于B、C、D組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并且F組顯著低于E組，相比之下，B、C、D組在BBB評(píng)分和Rivlin斜板試驗(yàn)功能角度值并未見(jiàn)明顯差異；SCI后各組均出現(xiàn)脊髓水腫、出血、炎癥及壞死等病理?yè)p害，單純SCI組的上述病理?yè)p害在12h達(dá)到高峰，而海水浸泡組在3h、6h時(shí)病理?yè)p害相對(duì)較輕，但在12h、24h及72h時(shí)觀察發(fā)現(xiàn)脊髓組織水腫、出血、炎癥及壞死等病理?yè)p害迅速加劇，且在程度上已明顯重于單純脊髓損傷組及生理鹽水浸泡組，并且浸泡60min較30min病理改變程度為重，而生理鹽水浸泡組各時(shí)間點(diǎn)觀察與單純脊髓損傷組無(wú)明顯差異。 2. SCI后各組大鼠BBB評(píng)分和Rivlin斜板試驗(yàn)功能角度值均顯著下降，其后均有所恢復(fù)，但觀察至8w與術(shù)前相比仍顯著低下，SCI各組大鼠在24h時(shí)BBB評(píng)分和Rivlin斜板試驗(yàn)功能角度值未見(jiàn)顯著差異，而72h~8w的各時(shí)間點(diǎn)SW組均顯著低于SCI組，Lipo PGE1組均顯著高于SW組及SCI組；SCI后MEP信號(hào)均消失，24h時(shí)可以再次記錄到MEP信號(hào)，主要表現(xiàn)為潛伏期的延長(zhǎng)，波幅的下降，其后各組均有所恢復(fù)，各組觀察至8w其潛伏期和波幅均未能恢復(fù)至傷前水平，SCI各組大鼠在24h時(shí)潛伏期及波幅無(wú)明顯差異，72h~8w的各時(shí)間點(diǎn)SW組與SCI組相比潛伏期均顯著延長(zhǎng)、波幅顯著下降，而Lipo PGE1組潛伏期均較SW組及SCI組顯著縮短，而波幅均顯著增加；各組大鼠SCI后即刻血流速度均顯著下降，且各組間無(wú)明顯差異，然后，SW組和Lipo PGE1組按實(shí)驗(yàn)要求進(jìn)行海水浸泡及給藥，兩組血流速度在浸泡結(jié)束后進(jìn)一步下降，兩組間血流速度無(wú)明顯差異，而此時(shí)SCI組血流速度則略有恢復(fù)，且已明顯高于上述兩組，1h、2h時(shí)各組血流速度均有所恢復(fù)，1h時(shí)三組間血流速度間均具有顯著差異，SCI組＞Lipo PGE1組＞SW組，，至2h時(shí)Lipo PGE1組的血流速度僅略低于SCI組，兩者已無(wú)明顯差異，但SW組改善緩慢，已顯著低于上述兩組，然而3h時(shí)各組血流速度再次下降，6h時(shí)SCI組及SW組血流速度繼續(xù)小幅下降，而LipoPGE1組則明顯改善，且已明顯高于SCI組，三組間已有顯著差異， Lipo PGE1組＞SCI組＞SW組，此后三組血流速度均繼續(xù)恢復(fù)，觀察至72h各組均未能恢復(fù)至損傷前水平。 3.各組大鼠脊髓在SCI后3h開(kāi)始凋亡細(xì)胞均顯著增加，并呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，各組凋亡指數(shù)（AI）均在24h達(dá)到最高，隨后開(kāi)始下降，至1w仍可檢出較多的凋亡細(xì)胞（SW組＞SCI組＞Lipo PGE1組），在3h、6h時(shí)SW組和Lipo PGE1組AI無(wú)明顯差異，并且均顯著低于SCI組，而在其后的各時(shí)間點(diǎn)SW組則顯著高于Lipo PGE1組和SCI組，且Lipo PGE1組顯著低于SCI組；SCI后各組3h開(kāi)始Bcl-2、Bax表達(dá)均顯著增加，并呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，各組Bcl-2表達(dá)均在24h達(dá)到最高，而B(niǎo)ax表達(dá)均在12h達(dá)到高峰，隨后均開(kāi)始下降，至1w均仍有較高表達(dá)，SW組Bcl-2表達(dá)在各時(shí)間點(diǎn)均顯著低于SCI組，而B(niǎo)ax的表達(dá)則比較特殊，在3h和6h時(shí)顯著低于SCI組，而在其后的各時(shí)間點(diǎn)均顯著高于SCI組；Lipo PGE1組在各時(shí)間點(diǎn)Bcl-2表達(dá)均顯著高于SW組和SCI組，而B(niǎo)ax表達(dá)則均低于上述兩組。 結(jié)論： 1.海水浸泡脊髓開(kāi)放性損傷大鼠模型穩(wěn)定、可靠；海水浸泡可以使脊髓開(kāi)放性損傷大鼠的神經(jīng)功能惡化，并且浸泡時(shí)間越長(zhǎng)影響越大；海水浸泡早期可以推遲并減輕損傷段脊髓水腫、出血、炎癥及壞死等病理?yè)p害表現(xiàn)，但最終作用是使上述病理?yè)p害重于單純損傷段脊髓。 2.無(wú)論是行為學(xué)觀察還是神經(jīng)電生理檢測(cè)均證實(shí)海水浸泡可以對(duì)脊髓開(kāi)放性損傷后的神經(jīng)功能造成長(zhǎng)期的影響，不利于其恢復(fù)；SCI后脊髓血流速度會(huì)顯著降低，海水浸泡可以使損傷后的血流速度進(jìn)一步減慢并延長(zhǎng)其恢復(fù)時(shí)間；早期應(yīng)用LipoPGE1靜脈注射治療可以改善海水浸泡脊髓開(kāi)放性損傷后的神經(jīng)功能及血流速度，并促進(jìn)它們的恢復(fù)。 3.海水浸泡可以使脊髓開(kāi)放性損傷后神經(jīng)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2及Bax的表達(dá)上調(diào)，但是與單純損傷大鼠相比，Bcl-2的表達(dá)較少，而B(niǎo)ax表達(dá)卻明顯較多，從而促進(jìn)了神經(jīng)細(xì)胞的凋亡；早期應(yīng)用Lipo PGE1靜脈注射治療可以上調(diào)Bcl-2的表達(dá)、下調(diào)Bax的表達(dá)，從而起到抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡的作用。
【圖文】：

全部結(jié)束后沖洗創(chuàng)面，用 4-0 絲線逐層縫合切口并消毒處理皮膚。開(kāi)始記錄每只大鼠SCI 造模成功后的時(shí)間。（脊髓損傷模型制作過(guò)程見(jiàn)圖 1-1。）圖1-1 脊髓損傷模型制作過(guò)程

共消耗4%的多聚甲醛約200ml，耗時(shí)約1小時(shí)。沿原手術(shù)切口剪開(kāi)背部皮膚直至椎體，仔細(xì)游離并完整取出傷段及頭尾段共1.0cm的脊髓組織，放入預(yù)盛有4％多聚甲醛的標(biāo)本盒中固定24小時(shí)。（大鼠灌注取材過(guò)程見(jiàn)圖1-2。）圖1-2 大鼠的灌注及脊髓標(biāo)本的取材2、標(biāo)本包埋及切片制作（1）沖洗：將固定好的標(biāo)本修剪好后自來(lái)水沖洗24h；（2）梯度脫水： 70%酒精24h→80%酒精24h→95%酒精12h→無(wú)水酒精Ⅰ2h→無(wú)水酒精Ⅱ2h；（3）組織透明：組織脫水后投入二甲苯：無(wú)水酒精（1:1）混合液30min→二甲苯Ⅰ15min→二甲苯 Ⅱ1 0min；（4）浸蠟：石蠟Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ及包埋蠟放入烘箱中熔化備用，于50℃烘箱中進(jìn)行
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類(lèi)號(hào)】：R651.2;R-332

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2706473