發(fā)布時間：2020-05-30 21:26

【摘要】： 解決病毒持續(xù)存在的免疫學和病毒學機制、研究清除細胞內病毒感 染的特異性治療方法和免疫干預藥物是HBV研究重點。HLA-Ⅰ類分子介導 的T細胞免疫，特別是由抗原特異性CTL介導的細胞毒作用，是清除胞內 病毒感染的關鍵。所以研究基于HBV抗原CTL表位的新一代疫苗或免疫干 預藥物，以在體啟動T細胞介導的免疫應答，有望終止細胞內病毒感染。 由于天然病原體及抗原可通過多種機制逃避機體的免疫監(jiān)視和免疫清除， 所以，必須對天然抗原分子及其表位肽進行重新設計，使改構后的新型免 疫原能夠誘發(fā)與自然感染過程有所不同的免疫反應。 本課題采用InsightⅡ系列軟件，對天然HBV Pre-S2、HBsAg和HBcAg 抗原進行分子結構模建，根據表位的優(yōu)勢性，選擇HBV PreS_2蛋白的免疫 優(yōu)勢性B細胞表位（18-24）、Th細胞表位（37-53）和HBcAg的CTL細胞 表位（18-27）為研究對象。應用基于表位進行多肽和疫苗設計的技術路 線，以所篩選出的表位進行抗原設計。根據Chaiken等的研究，設計出短 而柔性較強的表位間連接順序—AAA—。然后根據可能的組合方式對所篩 選出的表位進行合理組合與搭配，在計算機上進行分子結構模建，檢查各 種組合方式對多肽空間結構的影響，有無空間位阻存在，并重新調整表位 組合，確定三種有代表性的多肽分子，即CTL表位肽、CTL+Th表位組合 肽、CTL+Th+B細胞表位組合肽。用Merrifield固相化學合成法進行多肽 合成，獲得新型免疫原分子。 由于多肽尤其是短肽的免疫原性通常較低，達不到引起免疫應答的 水平。而且傳統(tǒng)載體或佐劑免疫效果較差，因此本課題采用分子內佐劑的 設計思路，將P－KSS脂肽佐劑基團構建于多肽抗原分于內部，以捉高多JJ太 疫苗的免疫原性。激發(fā)體內CTL反應。降低毒副作用。P－KSS分別與確定 的三種多肽分子進行卜末端連接，經計算機分子結構模建，并與天然抗 原進行空間構象相似性、表位可及性等比較后，確定最佳連接順序，，構建 不同的分子內佐劑肽叫（含 CTL表位＼ PAZ（含 CTL／l’h ＆位入 I“3（含 CTL、B、I’h表位人 并用固相化學合成法進行合成。 糖基化是蛋白質最重要的翻譯后修飾形式，多肽鏈經某些形式的娜 譯后修飾（如糖基化、脂化）之后，可能提高多肽與質膜的親和力，提高 小肽分子對抗夕、熱、蛋白酶的能力，提高多肽的穩(wěn)定性。蛋白質或多肽 的翻譯修飾參與并影響了T細胞應答，而T細胞對細胞表面蛋白的識別必 包括對糖基的識別。已有研究認為，多肽鏈側鏈的一個糖基替代就能直接 與 MfIC分子和 TCR發(fā)生交互作用。近年來已有關于糖基化合成肽誘導 T細 胞應答的多項報道。HBV的表面抗原均是糖蛋白，有關11BV抗原糖基化的 研究主要集中在N－，0－糖基化方面，目前公認N－糖基化是HBV ；W粒組裝 和分泌必需的，而0－糖基化則無直接關系。本課題選擇N－糖基化修傭泊b 1詛V顯性表位多肽和卜r鉆蛋臼，同前進行計算機結構腆建后，用糖肽 化學合成法進行合成，獲得基于 CTL表位的糖基化新型多肽抗原 GP（含 CTL表位）、GPZ（含CTL、1上表位）、GP3（含CTL、B、Th表位）。 上述多肽抗原分別進行化學切割，去除樹脂與保護基團之后，再ll盯C 法進行純化和鑒定，得純化的多肽抗原，分別用于體內外兔疫學試驗和細 胞靶向抗原的合成。 APC通過經典的胞吞、胞飲方式對抗原的攝取，無法保證抗原攝取 的特異性，且效率低下；而受體介導的內吞作用（Receptor medianed endocytosis）可保證攝取抗原的特異性，并能使抗原遞呈效率提高 10‘－’倍。 本課題選擇轉鐵蛋白特異性單抗的 F；仆；；。為細胞間靶向順序，以特異性 地結合專職APC和非專職APC的受體。皿過引入專職APC和非專職APC 間的靶向基團，以期能啟動T細胞與靶細胞之間的直接識別機制，從而 提高抗原的遞呈效率，提高小肽分子的免疫原性。探討影【I�、倜庖邞鹦Ч� XI ；一＼i 的因素，研究表位結構與兔疫應答的關系。所選擇的細胞靶向結構與新設 計的表位連接順序，經計算機分子結構建模、與天然抗原分子進行構象比 較和篩選之后，確定細胞靶向性多肽免疫原門。F3和 IgGI。Ier－ SZ人 以戊二醛為交聯劑，經手工液相連接之后，進行超速濃縮法、高效 液相色譜法和聚丙烯酚胺電泳法進行純化和鑒定。 所得多肽抗原分別在 Balb兒（H上勺小鼠和和 HLA－AZ”正常人。急性 肝炎恢復期病人和慢性乙型肝炎病人的外周血淋巴細胞中進行了體內、外 試驗，分別就其體內力誘導T細胞增殖、分化；誘導抗體產生：誘導Th汀 型 T細 ］Jfu極化；誘導 HBV抗原特異性 CTL產生及其介導的則胞Ity作）IJ 等功能進行了檢測。比較研究基于不同表位組合的多肽分子的體內、外兔 疫學特性，其結構與誘導免疫應答的關系；研究脂類分子內佐劑和 APC 靶向基團的引入及糖基化
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2001
【分類號】：R392.11

【參考文獻】

相關期刊論文 前8條

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本文編號：2688746