【摘要】： 解決病毒持續(xù)存在的免疫學(xué)和病毒學(xué)機(jī)制、研究清除細(xì)胞內(nèi)病毒感 染的特異性治療方法和免疫干預(yù)藥物是HBV研究重點(diǎn)。HLA-Ⅰ類分子介導(dǎo) 的T細(xì)胞免疫，特別是由抗原特異性CTL介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用，是清除胞內(nèi) 病毒感染的關(guān)鍵。所以研究基于HBV抗原CTL表位的新一代疫苗或免疫干 預(yù)藥物，以在體啟動(dòng)T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，有望終止細(xì)胞內(nèi)病毒感染。 由于天然病原體及抗原可通過(guò)多種機(jī)制逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視和免疫清除， 所以，必須對(duì)天然抗原分子及其表位肽進(jìn)行重新設(shè)計(jì)，使改構(gòu)后的新型免 疫原能夠誘發(fā)與自然感染過(guò)程有所不同的免疫反應(yīng)。 本課題采用InsightⅡ系列軟件，對(duì)天然HBV Pre-S2、HBsAg和HBcAg 抗原進(jìn)行分子結(jié)構(gòu)模建，根據(jù)表位的優(yōu)勢(shì)性，選擇HBV PreS_2蛋白的免疫 優(yōu)勢(shì)性B細(xì)胞表位（18-24）、Th細(xì)胞表位（37-53）和HBcAg的CTL細(xì)胞 表位（18-27）為研究對(duì)象。應(yīng)用基于表位進(jìn)行多肽和疫苗設(shè)計(jì)的技術(shù)路 線，以所篩選出的表位進(jìn)行抗原設(shè)計(jì)。根據(jù)Chaiken等的研究，設(shè)計(jì)出短 而柔性較強(qiáng)的表位間連接順序—AAA—。然后根據(jù)可能的組合方式對(duì)所篩 選出的表位進(jìn)行合理組合與搭配，在計(jì)算機(jī)上進(jìn)行分子結(jié)構(gòu)模建，檢查各 種組合方式對(duì)多肽空間結(jié)構(gòu)的影響，有無(wú)空間位阻存在，并重新調(diào)整表位 組合，確定三種有代表性的多肽分子，即CTL表位肽、CTL+Th表位組合 肽、CTL+Th+B細(xì)胞表位組合肽。用Merrifield固相化學(xué)合成法進(jìn)行多肽 合成，獲得新型免疫原分子。 由于多肽尤其是短肽的免疫原性通常較低，達(dá)不到引起免疫應(yīng)答的 水平。而且傳統(tǒng)載體或佐劑免疫效果較差，因此本課題采用分子內(nèi)佐劑的 設(shè)計(jì)思路，將P－KSS脂肽佐劑基團(tuán)構(gòu)建于多肽抗原分于內(nèi)部，以捉高多JJ太 疫苗的免疫原性。激發(fā)體內(nèi)CTL反應(yīng)。降低毒副作用。P－KSS分別與確定 的三種多肽分子進(jìn)行卜末端連接，經(jīng)計(jì)算機(jī)分子結(jié)構(gòu)模建，并與天然抗 原進(jìn)行空間構(gòu)象相似性、表位可及性等比較后，確定最佳連接順序，，構(gòu)建 不同的分子內(nèi)佐劑肽叫（含 CTL表位＼ PAZ（含 CTL／l’h ＆位入 I“3（含 CTL、B、I’h表位人 并用固相化學(xué)合成法進(jìn)行合成。 糖基化是蛋白質(zhì)最重要的翻譯后修飾形式，多肽鏈經(jīng)某些形式的娜 譯后修飾（如糖基化、脂化）之后，可能提高多肽與質(zhì)膜的親和力，提高 小肽分子對(duì)抗夕、熱、蛋白酶的能力，提高多肽的穩(wěn)定性。蛋白質(zhì)或多肽 的翻譯修飾參與并影響了T細(xì)胞應(yīng)答，而T細(xì)胞對(duì)細(xì)胞表面蛋白的識(shí)別必 包括對(duì)糖基的識(shí)別。已有研究認(rèn)為，多肽鏈側(cè)鏈的一個(gè)糖基替代就能直接 與 MfIC分子和 TCR發(fā)生交互作用。近年來(lái)已有關(guān)于糖基化合成肽誘導(dǎo) T細(xì) 胞應(yīng)答的多項(xiàng)報(bào)道。HBV的表面抗原均是糖蛋白，有關(guān)11BV抗原糖基化的 研究主要集中在N－，0－糖基化方面，目前公認(rèn)N－糖基化是HBV ；W粒組裝 和分泌必需的，而0－糖基化則無(wú)直接關(guān)系。本課題選擇N－糖基化修傭泊b 1詛V顯性表位多肽和卜r鉆蛋臼，同前進(jìn)行計(jì)算機(jī)結(jié)構(gòu)腆建后，用糖肽 化學(xué)合成法進(jìn)行合成，獲得基于 CTL表位的糖基化新型多肽抗原 GP（含 CTL表位）、GPZ（含CTL、1上表位）、GP3（含CTL、B、Th表位）。 上述多肽抗原分別進(jìn)行化學(xué)切割，去除樹(shù)脂與保護(hù)基團(tuán)之后，再ll盯C 法進(jìn)行純化和鑒定，得純化的多肽抗原，分別用于體內(nèi)外兔疫學(xué)試驗(yàn)和細(xì) 胞靶向抗原的合成。 APC通過(guò)經(jīng)典的胞吞、胞飲方式對(duì)抗原的攝取，無(wú)法保證抗原攝取 的特異性，且效率低下；而受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用（Receptor medianed endocytosis）可保證攝取抗原的特異性，并能使抗原遞呈效率提高 10‘－’倍。 本課題選擇轉(zhuǎn)鐵蛋白特異性單抗的 F；仆；；。為細(xì)胞間靶向順序，以特異性 地結(jié)合專職APC和非專職APC的受體。皿過(guò)引入專職APC和非專職APC 間的靶向基團(tuán)，以期能啟動(dòng)T細(xì)胞與靶細(xì)胞之間的直接識(shí)別機(jī)制，從而 提高抗原的遞呈效率，提高小肽分子的免疫原性。探討影【I�、倜庖邞�(yīng)答效果 XI ；一＼i 的因素，研究表位結(jié)構(gòu)與兔疫應(yīng)答的關(guān)系。所選擇的細(xì)胞靶向結(jié)構(gòu)與新設(shè) 計(jì)的表位連接順序，經(jīng)計(jì)算機(jī)分子結(jié)構(gòu)建模、與天然抗原分子進(jìn)行構(gòu)象比 較和篩選之后，確定細(xì)胞靶向性多肽免疫原門。F3和 IgGI。Ier－ SZ人 以戊二醛為交聯(lián)劑，經(jīng)手工液相連接之后，進(jìn)行超速濃縮法、高效 液相色譜法和聚丙烯酚胺電泳法進(jìn)行純化和鑒定。 所得多肽抗原分別在 Balb兒（H上勺小鼠和和 HLA－AZ”正常人。急性 肝炎恢復(fù)期病人和慢性乙型肝炎病人的外周血淋巴細(xì)胞中進(jìn)行了體內(nèi)、外 試驗(yàn)，分別就其體內(nèi)力誘導(dǎo)T細(xì)胞增殖、分化；誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生：誘導(dǎo)Th汀 型 T細(xì) ］Jfu極化；誘導(dǎo) HBV抗原特異性 CTL產(chǎn)生及其介導(dǎo)的則胞Ity作）IJ 等功能進(jìn)行了檢測(cè)。比較研究基于不同表位組合的多肽分子的體內(nèi)、外兔 疫學(xué)特性，其結(jié)構(gòu)與誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的關(guān)系；研究脂類分子內(nèi)佐劑和 APC 靶向基團(tuán)的引入及糖基化
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2001
【分類號(hào)】：R392.11

【參考文獻(xiàn)】

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