【摘要】： 本研究根據(jù)代謝工程原理系統(tǒng)分析了細(xì)胞代謝網(wǎng)絡(luò)，并利用DNA重組技術(shù)合理設(shè)計(jì)細(xì)胞代謝途徑及其遺傳修飾，進(jìn)而完成細(xì)胞特性改造。芳香族氨基酸包括酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸，是人體和動(dòng)物體內(nèi)的必需氨基酸。苯丙氨酸既是合成新型甜味劑Aspartame的原料，又是合成一些抗癌藥物的中間體和良好載體，市場(chǎng)需求日益增加。 大腸桿菌和許多微生物一樣，其合成芳香族氨基酸的起始物是由磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)和4-磷酸赤癬糖(E4P)二者縮合形成的3-脫氧-α-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸(DAHP)。PEP和E4P是DAHP合成的限制性底物，在大腸桿菌中，PEP又是許多酶的競(jìng)爭(zhēng)性底物，特別是負(fù)責(zé)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)的糖磷酸基轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)。ppsA基因編碼磷酸烯醇式丙酮酸合成酶A(PpsA)，該酶催化丙酮酸合成磷酸烯醇式丙酮酸；tktA基因編碼轉(zhuǎn)酮酶A，該酶在磷酸戊糖途徑中生成4-磷酸赤蘚糖起主要作用。芳香族氨基酸的合成步驟有七步是共同的，亦即從DAHP到分支酸的合成步驟，其中脫氫奎寧酸合成酶(AroB)、5-烯醇式丙酮酰莽草酸合成酶(AroA)和分支酸合成酶(AroC)是此代謝途徑的關(guān)鍵酶。分支酸是芳香族氨基酸合成途徑的分支點(diǎn)，與苯丙氨酸合成有關(guān)，雙功能酶分支酸變位酶-預(yù)苯酸脫水酶(pheA基因編碼)是關(guān)鍵酶。CsrA是整體調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控基因，可負(fù)調(diào)控指數(shù)生長(zhǎng)后期誘導(dǎo)的一些代謝途徑，包括糖原的生物合成、糖原的分解代謝、糖異生，，而對(duì)糖酵解的一些重要基因的表達(dá)則執(zhí)行正調(diào)控功能，CsrA也調(diào)控直接參與PEP代謝的三個(gè)酶的活性水平。另外，一些間接影響PEP的酶也被CsrA所調(diào)控，因此csrA的敲除不但可以使細(xì)胞內(nèi)的PEP的量大大增加，而且打破了細(xì)胞固有的生理代謝協(xié)調(diào)，使碳代謝流盡可能多的流向苯丙氨酸的生物合成方向�；谏鲜龇治�，本文主要從以下三個(gè)方面對(duì)苯丙氨酸基因工程菌進(jìn)行了改造： 1．從大腸桿菌ATCC31884的基因組中克隆并表達(dá)了PEP合成酶基因ppsA和合成E4P的關(guān)鍵基因tkt4，用原核高效表達(dá)載體pBV220分別實(shí)現(xiàn)了兩種蛋白的高效表達(dá)，其酶活性分別比對(duì)照菌提高了10.8和3.9倍； 考乏季芝羌凄了毫履{全渺分成;送窟屏務(wù)鄉(xiāng)論乎鄉(xiāng)之 亨孑靈蘇亥穿 2.構(gòu)建了這兩個(gè)基因的不同形式的串聯(lián)表達(dá)重組子:PPT-I、PPT-ll、PTP一I、 PTP一n，其中PPsA的活性升高了2一9倍，TktA的活性升高了3 .9一4.5倍;通過(guò) DAHP含量的測(cè)定，結(jié)果表明串聯(lián)重組子中DAHP的含量比對(duì)照菌高約一倍， 篩選并確定PPT-H、PTP一工這兩種串聯(lián)方式效率最高，提示我們:多基因串聯(lián) 表達(dá)時(shí)，其各個(gè)酶活性比較協(xié)調(diào)一致的重組子可能為最佳組合。 3.從大腸桿菌中克隆了莽草酸途徑關(guān)鍵酶基因aro刁、aroC、aroB及整體代謝 調(diào)控基因CsrA及其側(cè)翼序列;從質(zhì)粒pET28a中克隆了Kan抗性基因; 4.構(gòu)建了基因盒子aroAar口CaroBKan，在其前面加入了強(qiáng)啟動(dòng)子Ptac，初步證 明了pta。和Kan是有活性的; 5.成功的構(gòu)建了線性化片斷CsrA尸tacaro月aroCaroBKdnCsrA，為基因敲除和基 因替換做好了準(zhǔn)備;利用Red重組系統(tǒng)成功地進(jìn)行了基因敲除和基因替換，PCR 和Southem blot鑒定其為正確的，并穩(wěn)定了敲除和替換菌株的基因型，把這株菌 株定名為大腸桿菌31884△c甲B; 6.觀察到菌落形態(tài)和生長(zhǎng)狀況的改變，實(shí)驗(yàn)證實(shí)大腸桿菌31884△C甲B比對(duì)照 菌大腸桿菌31884△T在產(chǎn)酸率上高4.53倍，而糖消耗上兩者差異并不大，這充 分說(shuō)明前者能在細(xì)胞內(nèi)積累更多的糖原，并得到有效的利用。莽草酸途徑的最優(yōu) 化和整體調(diào)控基因CsrA的敲除正是上述改變的分子基礎(chǔ)，同時(shí)也為三種芳香族 氨基酸的基因工程菌的構(gòu)建打下了基礎(chǔ); 7.在國(guó)內(nèi)外首次實(shí)現(xiàn)了共同途徑限制性底物關(guān)鍵酶PPsA刁無(wú)‘」及aroG與分支 途徑關(guān)鍵酶基因pheA的串聯(lián)高效表達(dá)，所構(gòu)建的重組質(zhì)粒PTGA，其PPsA、TktA、 AroG、CM和PD的酶活分別比對(duì)照提高了3、2、2，5、4、2.3倍，且其酶活比 較協(xié)調(diào)一致; 8.將PTGA導(dǎo)入到篩選的基因敲除和基因替換菌株大腸桿菌3 1 884△C甲B中， 搖瓶發(fā)酵證實(shí)比以往所構(gòu)建的基因工程菌株具有較高的phe產(chǎn)量和糖轉(zhuǎn)化率率， 分別為0.448%和22.4%。在BIOFLO3000 Bateh/Continuous Bioreaetor(SL)進(jìn)行發(fā) 酵試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，發(fā)酵液中副生雜酸較少，產(chǎn)品經(jīng)初步純化后純度較高，可達(dá) 93%。熔點(diǎn)、旋光度測(cè)定和紅外光譜分析證實(shí)產(chǎn)物為苯丙氨酸。 總之，從工業(yè)化生產(chǎn)上所要求的產(chǎn)量、產(chǎn)率和產(chǎn)品純度這三方面考慮，本試 驗(yàn)所構(gòu)建的基因工程菌株都達(dá)到或基本達(dá)到要求，從而為工業(yè)化生產(chǎn)打下了基 礎(chǔ)，為今后氨基酸生物合成特別是芳香族氨基酸的生物合成提供了一個(gè)新思路。
【圖文】：

進(jìn)行酶切鑒定。重組質(zhì)粒經(jīng)Ec口RI和BamHI、BamRI和SPhl雙酶切各自產(chǎn)生與預(yù)計(jì)的大小相符的片段，表明檢測(cè)質(zhì)粒確系陽(yáng)性重組質(zhì)粒，命名為pGEM一T-E了少sA，pGEM一T-E寸助月。圖1一3、1一4分別為重組質(zhì)粒pGEM一下E一sA，pGEM一T-E一tk乙搜的酶切鑒定結(jié)果。ABCDEFG

聲破碎后的上清進(jìn)行SDS一PAGE分析，以含空載體的菌為陰性對(duì)照。電泳圖譜上，經(jīng)42℃誘導(dǎo)的重組菌D娜a(PBV22口，，sA)，D乃巧a加BV22口襯無(wú)叫分別在相當(dāng)于分子量84kD和73kD處，顯示新增蛋白帶，與預(yù)期的分子量一致，見(jiàn)圖1一7。薄層掃描結(jié)果顯示，pBV22o，P1，sA/DHSQ，pBV220寸無(wú)“/DHS。全菌體裂解物中目的蛋白的表達(dá)量分別占菌體總蛋白量的55%，40%，上清中目的蛋白的表達(dá)量占上清總蛋白量的51%，30%。么BCDE97.減66。2減3。O14、4-圖1一7重組質(zhì)粒嗜PBV220了少劉
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2003
【分類號(hào)】：Q516

【引證文獻(xiàn)】

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2 鄭月;蘿芙木MCT、HDS、SGD基因的克隆與遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立[D];西南大學(xué);2011年

3 蘆佳;苯丙氨酸生物合成通路多酶基因協(xié)同表達(dá)研究[D];內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué);2011年

4 黃坤央;L-苯丙氨酸基因工程菌的構(gòu)建及其發(fā)酵條件研究[D];鄭州大學(xué);2012年

5 趙越;苯丙氨酸生物合成途徑多酶基因協(xié)同表達(dá)載體的構(gòu)建[D];內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué);2012年

本文編號(hào)：2682118