【摘要】： 【背景】 細(xì)胞對于外界環(huán)境變化的應(yīng)激過程是一個(gè)復(fù)雜的生物學(xué)過程。盡管相關(guān)性研究很多,但其分子機(jī)制以及細(xì)胞生理過程還不是很清楚。線粒體作為細(xì)胞內(nèi)關(guān)鍵的細(xì)胞器,處于不斷分裂與融合平衡之中,形態(tài)也隨之而改變,但是其生理意義尚不清楚。線粒體融合、分裂作為一種保守的細(xì)胞生理過程,從植物、線蟲、果蠅、大鼠、到人類都保持著線粒體動態(tài)的變化,所以推測其在生物體進(jìn)化過程中,與機(jī)體適應(yīng)外界環(huán)境的變化密切相關(guān)。寒冷作為一種機(jī)體外部環(huán)境變化因素,往往引起細(xì)胞內(nèi)部發(fā)生復(fù)雜的變化,從而產(chǎn)生一定的應(yīng)激反應(yīng)。線粒體作為細(xì)胞能量代謝中心,其功能的調(diào)節(jié)對于細(xì)胞寒冷應(yīng)激過程起到至關(guān)重要的作用。長時(shí)間及高強(qiáng)度寒冷應(yīng)激會導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)生損傷,其損傷可以是細(xì)胞壞死或是凋亡。溫度冰點(diǎn)以下導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)結(jié)晶,細(xì)胞膜破裂而引起細(xì)胞壞死;而在4℃環(huán)境中,細(xì)胞往往會出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象。以往研究發(fā)現(xiàn)ROS增多往往是細(xì)胞損傷主要原因,同時(shí)伴隨線粒體功能損害。Bcl-2家族作為細(xì)胞線粒體凋亡途徑的執(zhí)行者,可能參與了寒冷應(yīng)激引起的細(xì)胞凋亡,但其分子機(jī)制不清。 線粒體融合、分裂與細(xì)胞凋亡過程密切相關(guān)。線粒體分裂增多導(dǎo)致線粒體片段化,與細(xì)胞凋亡過程中線粒體形態(tài)相似,同時(shí)線粒體出現(xiàn)損傷,如線粒體膜電位降低,推測線粒體分裂很可能參與了線粒體途徑介導(dǎo)的凋亡過程。而線粒體融合增多可以改善線粒體功能,對細(xì)胞可能起到一定的保護(hù)作用。線粒體功能正常與否關(guān)系到細(xì)胞低溫環(huán)境中應(yīng)激能力,所以線粒體融合、分裂很可能參與了細(xì)胞寒冷應(yīng)激過程。 【目的】 研究冷應(yīng)激對細(xì)胞的損傷作用,從線粒體融合、分裂角度探討冷應(yīng)激誘導(dǎo)細(xì)胞損傷的分子機(jī)制,闡明丙酮酸在細(xì)胞冷應(yīng)激中的保護(hù)作用。 【方法】 (1)4℃環(huán)境培養(yǎng)建立HEK293細(xì)胞寒冷應(yīng)激模型。(2)應(yīng)用倒置顯微鏡、MTT方法、臺盼藍(lán)染色方法、Hoechst染色和流式細(xì)胞儀分析不同時(shí)間寒冷應(yīng)激對細(xì)胞形態(tài)、生存活力以及凋亡的影響。(3)細(xì)胞免疫熒光方法觀察Bax、Drp1和Mfn1細(xì)胞內(nèi)定位。(4)用MitoTracker線粒體熒光探針標(biāo)記線粒體,激光共聚焦顯微鏡觀察線粒體的動態(tài)變化。(5)用RT-PCR、Western blot技術(shù)檢測寒冷應(yīng)激對細(xì)胞線粒體融合、分裂蛋白表達(dá)的影響。(6)用2,7-二氯氫化熒光素染色,流式細(xì)胞儀分析寒冷應(yīng)激對細(xì)胞內(nèi)ROS生成的影響。(7)通過熒光素-熒光素酶( luciferin luciferase)的方法檢測細(xì)胞內(nèi)ATP的含量。(8)利用脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染法將構(gòu)建的si-Mfn1和其空載體轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞,G418篩選獲得穩(wěn)定的克隆;脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染法將預(yù)先合成的si-Mfn2 RNA轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞。(9)利用羅丹明123熒光染料標(biāo)記細(xì)胞,流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位(?Ψm)的變化。 【結(jié)果】 1.寒冷應(yīng)激對細(xì)胞的損傷作用 MTT結(jié)果顯示寒冷應(yīng)激2h、4h、8h和12h可引起細(xì)胞生存活力下降,12h降為最低;而寒冷應(yīng)激4h表現(xiàn)為細(xì)胞活力相對2h增高。倒置顯微鏡檢測結(jié)果表明寒冷應(yīng)激2h和12h細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)明顯皺縮及細(xì)胞漂浮現(xiàn)象。Hoechst染色結(jié)果顯示,與對照組相比寒冷應(yīng)激2h和8h細(xì)胞核出現(xiàn)致密濃染現(xiàn)象。流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果也顯示寒冷應(yīng)激2h、4h和8h細(xì)胞凋亡率分別為42.2%、33.6%和40.7%,提示寒冷應(yīng)激可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,而4h凋亡率低于2h。 2.寒冷誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡可能通過線粒體途徑實(shí)現(xiàn) 寒冷應(yīng)激后Bax表達(dá)水平無明顯變化;Bcl-2表達(dá)水平先是增高,在4h達(dá)高峰,而后漸低。細(xì)胞免疫熒光檢測結(jié)果顯示,寒冷刺激后2h、8h出現(xiàn)Bax線粒體轉(zhuǎn)位,2h寒冷刺激點(diǎn)出現(xiàn)細(xì)胞核皺縮及碎裂,線粒體出現(xiàn)片段化,提示線粒體在細(xì)胞寒冷應(yīng)激損傷中起著重要作用。 3.線粒體分裂、融合可能參與了細(xì)胞寒冷應(yīng)激過程并且和ATP生成有一定關(guān)系 激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果顯示在寒冷應(yīng)激過程中線粒體形態(tài)出現(xiàn)動態(tài)變化過程。應(yīng)激2h,線粒體斷裂增多;應(yīng)激4h,斷裂線粒體有一定程度的修復(fù);應(yīng)激10h,線粒體片段化又明顯增多。透射電鏡觀察線粒體超微結(jié)構(gòu),發(fā)現(xiàn)寒冷應(yīng)激4h線粒體為狹長、增大型,而8h線粒體變小、出現(xiàn)空泡化。線粒體融合蛋白Mfn1、Mfn2在寒冷應(yīng)激4h顯著增高,而線粒體分裂蛋白Drp1在寒冷應(yīng)激4h顯著降低,說明寒冷應(yīng)激4h線粒體融合增多。而在寒冷應(yīng)激2h,Drp1表達(dá)顯著增高,Mfn1、Mfn2增高不明顯,寒冷應(yīng)激8h Drp1表達(dá)顯著增高,Mfn1、Mfn2表達(dá)顯著降低,提示寒冷應(yīng)激2h、8h分裂增多。寒冷應(yīng)激后細(xì)胞內(nèi)ATP水平下降,2h、4h、8h和12h分別下降了46.4%、37.1%、64.0%和76.7%。4h ATP水平略高于2h水平,以上結(jié)果提示線粒體分裂增多ATP生成減少;融合增多時(shí),ATP生成有一定增多。 4.Mfn2蛋白在細(xì)胞寒冷應(yīng)激過程可能起關(guān)鍵作用 轉(zhuǎn)染si-Mfn1細(xì)胞,寒冷刺激4h對細(xì)胞存活沒有顯著影響;而轉(zhuǎn)染si-Mfn2細(xì)胞,寒冷刺激后細(xì)胞活力顯著下降并出現(xiàn)死亡。抑制Mfn2表達(dá),細(xì)胞寒冷應(yīng)激4h后,Mfn1、Mfn2和Bcl-2顯著降低,線粒體分裂蛋白Drp1表達(dá)增高,線粒體膜電位顯著降低,ATP生成明顯減少,細(xì)胞出現(xiàn)損傷,提示Mfn2蛋白在細(xì)胞寒冷應(yīng)激過程可能起重要的作用。 5.Drp1參與了寒冷應(yīng)激細(xì)胞損傷,丙酮酸具有保護(hù)作用 寒冷應(yīng)激2h,線粒體分裂增多,Drp1出現(xiàn)線粒體轉(zhuǎn)位,ATP生成減少,細(xì)胞發(fā)生凋亡。加入丙酮酸,可以部分逆轉(zhuǎn)寒冷刺激2h引起的細(xì)胞損傷,增加細(xì)胞ATP水平,抑制Drp1線粒體轉(zhuǎn)位,降低細(xì)胞凋亡率,對于細(xì)胞起到保護(hù)作用。 【結(jié)論】 1.寒冷應(yīng)激導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)兩個(gè)凋亡高峰,出現(xiàn)在寒冷應(yīng)激2h和8h。而在寒冷應(yīng)激4h細(xì)胞會出現(xiàn)一定適應(yīng)反應(yīng)。提示細(xì)胞自身可以對外界環(huán)境變化產(chǎn)生一定的應(yīng)激能力。 2.寒冷應(yīng)激誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡可能是通過線粒體途徑調(diào)節(jié)的,線粒體功能損傷伴隨細(xì)胞損傷過程,表現(xiàn)為細(xì)胞內(nèi)ATP生成減少。 3.線粒體融合、分裂過程參與了細(xì)胞寒冷應(yīng)激過程,并且與線粒體功能密切相關(guān)。線粒體融合增多改善細(xì)胞線粒體功能,抑制細(xì)胞損傷發(fā)生,提示線粒體融合增多是細(xì)胞產(chǎn)生應(yīng)激能力的分子機(jī)制。而線粒體分裂增多導(dǎo)致線粒體片段化,細(xì)胞出現(xiàn)損傷。提示線粒體過度分裂在細(xì)胞寒冷損傷中發(fā)生一定作用。 4.初步證實(shí)了Mfn2蛋白在細(xì)胞寒冷應(yīng)激過程可能起關(guān)鍵作用。 5.丙酮酸可以增加線粒體ATP生成,抑制寒冷應(yīng)激引起的Drp1線粒體轉(zhuǎn)位及線粒體分裂增多,對于細(xì)胞寒冷應(yīng)激損傷起一定的保護(hù)作用。
【圖文】：

第四軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文3.2 寒冷應(yīng)激對細(xì)胞形態(tài)的影響用倒置顯微鏡觀察寒冷暴露 2h、4h、8h 和 12h 細(xì)胞的形態(tài)變化（圖 1-2）結(jié)果顯示：寒冷暴露 2h 細(xì)胞明顯皺縮，4h 相對較少，12h 最多，并且發(fā)現(xiàn)大多數(shù)細(xì)胞有漂浮現(xiàn)象，寒冷應(yīng)激 2h 和 12h 可以引起細(xì)胞損傷。

4h 8h圖 1-3：Hoechst 染色觀察細(xì)胞核形態(tài)及細(xì)胞凋亡情況Fig.1-3 The cellular nucleus morphological changes and cell apoptosis were observedby hoechst stain3.4 細(xì)胞通過 Annexin V 和 PI 雙染，，流式細(xì)胞儀檢測寒冷應(yīng)激對細(xì)胞凋亡的影響通過前面 MTT、Hoechst 染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們新奇的發(fā)現(xiàn)細(xì)胞在 2h 損傷要嚴(yán)重于 4h。為了進(jìn)一步證實(shí)這一現(xiàn)象，我們通過 Annexin V 和 PI 雙染，流式細(xì)胞儀觀察細(xì)胞凋亡情況，發(fā)現(xiàn)結(jié)果同前面一致，細(xì)胞寒冷應(yīng)激-39-
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號】：R363

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本文編號：2663708