【摘要】： 一、研究背景和目的 煙曲霉是引起過(guò)敏性支氣管肺曲霉病、曲霉球和侵襲性曲霉病的空氣播散性的條件致病真菌。在免疫抑制患者中,導(dǎo)致致死性感染的重要原因是由于吸入煙曲霉分生孢子進(jìn)而發(fā)展為侵襲性曲霉病。由于癌癥、器官移植和其它原因造成免疫抑制患者逐漸增多,侵襲性曲霉病的發(fā)病率也逐年增加。盡管進(jìn)行了積極的抗真菌治療,侵襲性曲霉病的病死率仍維持在一個(gè)較高的水平。如何預(yù)防和治療這一類(lèi)疾病是個(gè)突出而且亟待解決的問(wèn)題。很多分子和基因與煙曲霉的毒力相關(guān)。但是,對(duì)于侵襲性曲霉病具體是哪一個(gè)毒力因子起主導(dǎo)作用目前仍然不是很清楚。幾丁質(zhì)是煙曲霉細(xì)胞壁上第三大類(lèi)多糖化合物并且有多種幾丁質(zhì)合成酶被檢測(cè)到。煙曲霉chs基因家族至少包括7種不同的基因,分別為chsA(組Ⅰ)、chsB(組Ⅱ)、chsC(組Ⅲ)、chsD(組Ⅵ)、chsE(組Ⅴ)、chsF(組Ⅳ)和chsG(組Ⅲ)。這些基因?qū)熐沟谋硇秃投玖Φ母淖兤鹬匾饔�。chsE-突變株能夠減少菌絲體和所有菌絲上幾丁質(zhì)的水平,也能減少分生孢子的受精作用;chsG-突變株顯示幾丁質(zhì)合成酶活性的降低,減少菌群的生長(zhǎng)半徑和高端菌絲生長(zhǎng),揭示這種酶在菌絲頂端發(fā)揮作用;chsE-/chsG-雙重突變對(duì)煙曲霉并不是致命的,它降低了幾丁質(zhì)合成酶的活性,其克隆的生長(zhǎng)速度也明顯減慢,此雙重突變體能夠產(chǎn)生更多的分枝菌絲。但是煙曲霉幾丁質(zhì)合成酶chsC在其生長(zhǎng)方式、形態(tài)及對(duì)抗真菌藥物的敏感性方面的作用仍然不是十分清楚。 目前,煙曲霉全基因組測(cè)序已經(jīng)完成,通過(guò)反向或正向遺傳轉(zhuǎn)化構(gòu)建突變體是一個(gè)有效的研究煙曲霉未知基因功能的方法。用原生質(zhì)體通過(guò)同源重組來(lái)打斷基因的方法曾經(jīng)被廣泛運(yùn)用,但此方法費(fèi)時(shí)、費(fèi)力,而且其同源重組的頻率也比較低。電穿孔和其它一些生物學(xué)的方法也經(jīng)常被應(yīng)用到煙曲霉的轉(zhuǎn)化中,但是這些方法都存在多拷貝插入和低同源重組等缺點(diǎn)。作為一種替代方法,根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化(ATMT)已經(jīng)在多種曲霉的轉(zhuǎn)化中得到應(yīng)用。本研究將把根癌農(nóng)桿菌作為工程菌應(yīng)用于插入突變煙曲霉的轉(zhuǎn)化中,構(gòu)建出煙曲霉幾丁質(zhì)合成酶基因缺失突變體,從而對(duì)煙曲霉幾丁質(zhì)合成酶基因在煙曲霉的生活方式、表型以及抗真菌藥物敏感性方面的作用作一探討。同時(shí)作為對(duì)ATMT這一新方法的探討,我們觀察了ATMT轉(zhuǎn)化的優(yōu)化條件。 二、方法與結(jié)果 1.根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的二元載體的構(gòu)建及鑒定高保真擴(kuò)增幾丁質(zhì)合成酶chsC基因兩端約500bp的片段,分別插入質(zhì)粒pPK2中潮霉素抗性序列的兩側(cè),將構(gòu)建好的的質(zhì)粒命名為pPK2/ chsC-::hph。用限制性內(nèi)切酶HindIII/SacI進(jìn)行雙酶切,把切下來(lái)約5.5kb的片段與用限制性內(nèi)切酶HindIII/SacI進(jìn)行雙酶切的pDHt/SK大片段相連接,構(gòu)建出的二元載體pDHt/chsC-::hph用于ATMT。二元載體用HindIII/SacI進(jìn)行雙酶切鑒定,載體切出兩條條帶,一條為5.5kb包含潮霉素抗性基因、構(gòu)巢曲霉啟動(dòng)子以及兩側(cè)的約500bp的chsC基因片段,另一條為約7.45kb的pDHt/SK載體片段,通過(guò)測(cè)序比對(duì)進(jìn)一步驗(yàn)證片段插入的正確性。 2.根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化對(duì)煙曲霉chsC基因的定點(diǎn)突變二元載體pDHt/chsC-::hph用氯化鈣法轉(zhuǎn)化至根癌農(nóng)桿菌EHA105中,轉(zhuǎn)化后的根癌農(nóng)桿菌命名為EHA105/chsC-。ATMT中我們用不同的共培養(yǎng)溫度(23、24、25、26、27、28℃),不同的轉(zhuǎn)化媒介(尼龍膜、硝化纖維素膜、液態(tài)靜置培養(yǎng)),不同的共培養(yǎng)時(shí)間(12、24、36、48h),預(yù)培養(yǎng)加或不加AS,共培養(yǎng)時(shí)培養(yǎng)基中加入不同濃度的AS(100、200、300、400μg/ml),共培養(yǎng)時(shí)用不同的分生孢子與根癌農(nóng)桿菌的比例(1:1、1:10、1:100、1:1000),以此來(lái)探討影響ATMT轉(zhuǎn)化效率的因素。用潮霉素篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子,轉(zhuǎn)化子接種到含高濃度潮霉素( 200、400μg/ml)的LB培養(yǎng)基中初步鑒定轉(zhuǎn)化子,進(jìn)一步鑒定用RT-PCR的方法。 二元載體pDHt/chsC-::hph可用氯化鈣法轉(zhuǎn)化進(jìn)入根癌農(nóng)桿菌EHA105中。用尼龍膜和液態(tài)靜置培養(yǎng)法在ATMT中具有相似的轉(zhuǎn)化效率,但硝化纖維素膜的轉(zhuǎn)化效率明顯低于尼龍膜和液態(tài)靜置培養(yǎng);共培養(yǎng)溫度為25℃時(shí)ATMT轉(zhuǎn)化效率最高,高于或低于該溫度轉(zhuǎn)化效率均有下降;隨著共培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),轉(zhuǎn)化效率也隨之增加,但共培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)如72h,由于轉(zhuǎn)化子太多而不容易挑取單克隆;當(dāng)分生孢子與農(nóng)桿菌的比例在1:1到1:100時(shí),隨著比例的增加ATMT轉(zhuǎn)化效率相應(yīng)提高,但當(dāng)其比例達(dá)到1:1000時(shí),轉(zhuǎn)化效率不再增加;預(yù)培養(yǎng)加入AS與否對(duì)轉(zhuǎn)化效率無(wú)明顯影響,共培養(yǎng)時(shí)隨著加入AS濃度的增加其轉(zhuǎn)化效率也相應(yīng)提高。陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子在含有高濃度的潮霉素環(huán)境中能正常生長(zhǎng)。RT-PCR法檢測(cè)轉(zhuǎn)化子發(fā)現(xiàn)ATMT能成功轉(zhuǎn)化T-DNA到煙曲霉染色體基因組中,定點(diǎn)插入并打斷失活chsC基因。 3.煙曲霉chsC基因缺失突變體基本特征的研究等量突變體分生孢子和野生型煙曲霉分生孢子接種到察氏培養(yǎng)基中,37℃孵育3d觀察二者的生長(zhǎng)速度。鋼圈法進(jìn)行小培養(yǎng)以觀察煙曲霉chsC-突變體和野生型煙曲霉MIDA1在形態(tài)學(xué)上的差異,用微量培養(yǎng)法觀察二者對(duì)抗真菌藥物敏感性的差異。應(yīng)用美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)制定的M38-A方案探討了煙曲霉chsC-突變體和野生型煙曲霉MIDA1對(duì)兩性霉素B(AmB)、特比奈芬(TBF)、伊曲康唑(ICZ)、氟胞嘧啶(5-Fc)和氟康唑(FCZ)的敏感性。 在生長(zhǎng)速度方面,煙曲霉chsC-突變體生長(zhǎng)速度明顯比野生型煙曲霉MIDA1慢,但大體菌落形態(tài)和顏色并無(wú)顯著變化。光鏡下野生型煙曲霉MIDA1,分生孢子鏈較短,分生孢子頭圓而飽滿,菌絲均勻飽滿。煙曲霉chsC-分生孢子鏈長(zhǎng),菌絲不均勻,部分可見(jiàn)膨大。電鏡高真空下野生型煙曲霉MIDA1,菌絲脫水塌陷,分生孢子較圓而飽滿;煙曲霉chsC-,菌絲脫水塌陷,分生孢子也脫水塌陷如癟乒乓球樣。電鏡低真空下野生型煙曲霉MIDA1,分生孢子及菌絲都較飽滿,分生孢子鏈較短;煙曲霉chsC-,菌絲易脫水塌陷,分生孢子鏈較長(zhǎng)。野生型煙曲霉MIDA1與煙曲霉MIDA1(chsC-)對(duì)5-Fc、AmB、FCZ、ICZ的MIC值上無(wú)明顯差異,但相對(duì)于TBF煙曲霉MIDA1(chsC-)的MIC值明顯低于野生型煙曲霉MIDA1。 三、結(jié)論 1.用煙曲霉EHA105和質(zhì)粒pDHt/SK組成的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)能夠成功轉(zhuǎn)化T-DNA到煙曲霉染色體基因組中,當(dāng)T-DNA兩側(cè)含有與煙曲霉基因組同源序列時(shí),T-DNA可以定點(diǎn)插入從而打斷和失活目標(biāo)基因; 2.轉(zhuǎn)化媒介、共培養(yǎng)溫度、共培養(yǎng)時(shí)間、分生孢子與根癌農(nóng)桿菌的比例、共培養(yǎng)時(shí)加入AS的濃度均對(duì)ATMT的轉(zhuǎn)化效率產(chǎn)生較大的影響,而預(yù)培養(yǎng)時(shí)加入AS與否對(duì)其轉(zhuǎn)化效率影響不顯著。 3.煙曲霉幾丁質(zhì)合成酶基因chsC在煙曲霉的生長(zhǎng)、形態(tài)和抗真菌藥物敏感性方面起著重要的作用。
【圖文】：

LG微波爐 韓國(guó)LG公司二、實(shí)驗(yàn)方法圖1-1 根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的二元載體pDHt/chsC-::hph構(gòu)建流程示意圖(一) 引物設(shè)計(jì)：從GenBank 中獲取煙曲霉基因chsC全序列(GenBank X94245)，通過(guò)PrimerPremier5.0 軟件設(shè)計(jì)，由上�；瞪锛夹g(shù)有限公司合成，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為501bp。引物序列為：P1F: 5’CCTTAATTAAGCGAGCTCTGGACGGTGACAGAGGT3’P1R: 5’CGGGGTACCCCATTGGGACTGGCTAAA3’P2F: 5’GCTCTAGAGGTCGCTAATGCCTTCA3’P2R: 5’CCCAGCTTCGAAAGTTGCGGTAGGAA3’(二) 煙曲霉分生孢子DNA的提取接種煙曲霉MIDA1至土豆葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，于37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)7-14d，

22圖1-2 質(zhì)粒pPK2圖譜1. pPK2質(zhì)粒的擴(kuò)增與提取質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌DH-5α，挑取陽(yáng)性克隆接種于5ml LB 培養(yǎng)基中，，加入Kan50μg/ml，37℃，185 rpm 恒溫振蕩過(guò)夜。收集4 ml菌液于10ml 離心管中，12 000rpm 離心1min棄上清按照質(zhì)粒提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取質(zhì)粒：(1) 用solutionⅠ充分懸浮細(xì)菌沉淀；(2) 加入25ml solutionII，上下反轉(zhuǎn)5～6次，直到菌體溶解；(3) 加入400ul 4 ℃ solutionIII
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類(lèi)號(hào)】：R379

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