發(fā)布時間：2020-05-07 23:30

【摘要】： ASB-8（human ankyrin repeat and SOCS box containing protein-8，ASB-8）是本實驗室在篩選腫瘤相關(guān)基因過程中，獲得的一個新的具有錨蛋白重復(fù)序列（Ankyrin repeats）和抑制細胞因子信號盒（Suppressor of cytokine signaling box，SOCS box） 的蛋白家族成員。 通過5(和3( RACE的方法獲得了該基因全長cDNA序列。序列分析表明，ASB-8含2,545 bp, 有完整的3'端和5'端，起始密碼子前同一編碼框內(nèi)有終止密碼子，poly A 前有加尾信號AATAAA。ASB-8的開放閱讀框含864bp，編碼288個氨基酸，預(yù)計分子量為31kD。經(jīng)過網(wǎng)上生物信息庫的同源比較，發(fā)現(xiàn)該基因編碼的蛋白和小鼠ASB-8在全序列水平上有96%的同源。利用RH（Radiation Hybrid）染色體定位方法把ASB-8定位在染色體12q13區(qū)段。ASB-8蛋白的結(jié)構(gòu)特點，近氨基端含一錨蛋白重復(fù)序列，由4個重復(fù)單元組成，長度為131個氨基酸殘基；羧基末端存在一長度為42個氨基酸殘基的SOCS盒。 Northern雜交顯示該基因的組織表達譜表明，在人的心、腦、胎盤、肝臟、骨骼肌和胰腺中均可檢測到一條大小約2.6kb轉(zhuǎn)錄本，其中在骨骼肌中表達最高，而肺組織中不表達。RT-PCR結(jié)果顯示該基因在多種腫瘤細胞系中呈較高水平的表達。利用ASB-8-EGFPN1轉(zhuǎn)染BEL-7402細胞進行亞細胞定位，該基因蛋白定位于細胞質(zhì)中。由于ASB-8 SOCS盒中特定氨基酸殘基位點并不保守，我們利用in vitro結(jié)合實驗和in vivo 免疫共沉淀觀察了ASB-8、缺失SOCS盒ASB-8突變體（1-235aa）、突變體M1 [249 (Thr?Asn) 和250 (Leu?Pro)] 與Elongin C和Elongin B的相互作用，，證實ASB-8基因可與Elongin B 和Elongin C結(jié)合，并且這一過程依賴于SOCS 盒的存在，第249位T和250位L的突變阻斷ASB-8與ElonginB C復(fù)合物的相互作用；提示ASB-8 基因可能參與對未知特定靶蛋白的降解。 經(jīng)免疫組化檢測，ASB-8在肺癌組織的表達高于相應(yīng)的癌旁組織。為了觀察 ASB-8對肺癌細胞生長的可能的調(diào)節(jié)作用， 我們以SPC-A1細胞系為研究對象，觀 WP=6 察過表達ASB-8 基因及其突變體對該細胞生長可能的調(diào)節(jié)作用；體外克隆形成試驗結(jié)果顯示，缺失SOCS 盒的ASB-8突變體（ASB-8(SB）對該細胞系有近53%的抑制率，而全長ASB-8對肺癌細胞的生長沒有影響。同時，我們將轉(zhuǎn)染上述表達載體的細胞經(jīng)過G418篩選后，進一步通過體內(nèi)外實驗觀察表位表達ASB-8 基因及其突變體對肺癌細胞系的影響，結(jié)果表明：轉(zhuǎn)染ASB-8(SB的SPC-A1肺癌細胞的增殖速度顯著慢于對照組細胞(P0.01)，而轉(zhuǎn)染ASB-8的細胞沒有明顯的生長特性改變；ASB-8 SOCS盒缺失突變體對SPC-A1細胞的體內(nèi)生長及腫瘤形成有一定的抑制作用(P0.01)。提示， 缺少SOCS盒的ASB-8突變體可能以dominant negative的作用方式，干擾細胞內(nèi)ASB-8蛋白的正常生理作用，從而起到抑制腫瘤細胞生長的作用，據(jù)此， 我們認為ASB-8可能參與了肺癌細胞的生長調(diào)節(jié)，并可能與該疾病的發(fā)生和發(fā)展有著一定的關(guān)系。 為了進一步觀察ASB-8在肺癌細胞生長調(diào)節(jié)中的可能機制，我們利用Atlas cDNA array分析了缺失SOCS 盒的ASB-8的突變體的表達對SPC-A1細胞的基因表達譜的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：該突變體的表達可以上調(diào)cAMP依賴的蛋白激酶A調(diào)節(jié)亞單位RI-(，TGF-( RIII，p38 MAP Kinase基因的表達，而這些基因可參與抑制細胞惡性轉(zhuǎn)化、誘導細胞停滯、凋亡等生物學過程；同時下調(diào)Zerin，c-myc和cdc25c基因，這些基因與促進細胞周期進程和增強腫瘤細胞遷移和侵襲等活性有關(guān)。上述基因在表達上的改變可能介導缺失SOCS 盒的ASB-8突變體對SPC-A1細胞的生長抑制。
【學位授予單位】：復(fù)旦大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2003
【分類號】：R346

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本文編號：2653720