發(fā)布時(shí)間：2020-05-07 23:30

【摘要】： ASB-8（human ankyrin repeat and SOCS box containing protein-8，ASB-8）是本實(shí)驗(yàn)室在篩選腫瘤相關(guān)基因過程中，獲得的一個(gè)新的具有錨蛋白重復(fù)序列（Ankyrin repeats）和抑制細(xì)胞因子信號盒（Suppressor of cytokine signaling box，SOCS box） 的蛋白家族成員。 通過5(和3( RACE的方法獲得了該基因全長cDNA序列。序列分析表明，ASB-8含2,545 bp, 有完整的3'端和5'端，起始密碼子前同一編碼框內(nèi)有終止密碼子，poly A 前有加尾信號AATAAA。ASB-8的開放閱讀框含864bp，編碼288個(gè)氨基酸，預(yù)計(jì)分子量為31kD。經(jīng)過網(wǎng)上生物信息庫的同源比較，發(fā)現(xiàn)該基因編碼的蛋白和小鼠ASB-8在全序列水平上有96%的同源。利用RH（Radiation Hybrid）染色體定位方法把ASB-8定位在染色體12q13區(qū)段。ASB-8蛋白的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，近氨基端含一錨蛋白重復(fù)序列，由4個(gè)重復(fù)單元組成，長度為131個(gè)氨基酸殘基；羧基末端存在一長度為42個(gè)氨基酸殘基的SOCS盒。 Northern雜交顯示該基因的組織表達(dá)譜表明，在人的心、腦、胎盤、肝臟、骨骼肌和胰腺中均可檢測到一條大小約2.6kb轉(zhuǎn)錄本，其中在骨骼肌中表達(dá)最高，而肺組織中不表達(dá)。RT-PCR結(jié)果顯示該基因在多種腫瘤細(xì)胞系中呈較高水平的表達(dá)。利用ASB-8-EGFPN1轉(zhuǎn)染BEL-7402細(xì)胞進(jìn)行亞細(xì)胞定位，該基因蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)中。由于ASB-8 SOCS盒中特定氨基酸殘基位點(diǎn)并不保守，我們利用in vitro結(jié)合實(shí)驗(yàn)和in vivo 免疫共沉淀觀察了ASB-8、缺失SOCS盒ASB-8突變體（1-235aa）、突變體M1 [249 (Thr?Asn) 和250 (Leu?Pro)] 與Elongin C和Elongin B的相互作用，，證實(shí)ASB-8基因可與Elongin B 和Elongin C結(jié)合，并且這一過程依賴于SOCS 盒的存在，第249位T和250位L的突變阻斷ASB-8與ElonginB C復(fù)合物的相互作用；提示ASB-8 基因可能參與對未知特定靶蛋白的降解。 經(jīng)免疫組化檢測，ASB-8在肺癌組織的表達(dá)高于相應(yīng)的癌旁組織。為了觀察 ASB-8對肺癌細(xì)胞生長的可能的調(diào)節(jié)作用， 我們以SPC-A1細(xì)胞系為研究對象，觀 WP=6 察過表達(dá)ASB-8 基因及其突變體對該細(xì)胞生長可能的調(diào)節(jié)作用；體外克隆形成試驗(yàn)結(jié)果顯示，缺失SOCS 盒的ASB-8突變體（ASB-8(SB）對該細(xì)胞系有近53%的抑制率，而全長ASB-8對肺癌細(xì)胞的生長沒有影響。同時(shí)，我們將轉(zhuǎn)染上述表達(dá)載體的細(xì)胞經(jīng)過G418篩選后，進(jìn)一步通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)觀察表位表達(dá)ASB-8 基因及其突變體對肺癌細(xì)胞系的影響，結(jié)果表明：轉(zhuǎn)染ASB-8(SB的SPC-A1肺癌細(xì)胞的增殖速度顯著慢于對照組細(xì)胞(P0.01)，而轉(zhuǎn)染ASB-8的細(xì)胞沒有明顯的生長特性改變；ASB-8 SOCS盒缺失突變體對SPC-A1細(xì)胞的體內(nèi)生長及腫瘤形成有一定的抑制作用(P0.01)。提示， 缺少SOCS盒的ASB-8突變體可能以dominant negative的作用方式，干擾細(xì)胞內(nèi)ASB-8蛋白的正常生理作用，從而起到抑制腫瘤細(xì)胞生長的作用，據(jù)此， 我們認(rèn)為ASB-8可能參與了肺癌細(xì)胞的生長調(diào)節(jié)，并可能與該疾病的發(fā)生和發(fā)展有著一定的關(guān)系。 為了進(jìn)一步觀察ASB-8在肺癌細(xì)胞生長調(diào)節(jié)中的可能機(jī)制，我們利用Atlas cDNA array分析了缺失SOCS 盒的ASB-8的突變體的表達(dá)對SPC-A1細(xì)胞的基因表達(dá)譜的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：該突變體的表達(dá)可以上調(diào)cAMP依賴的蛋白激酶A調(diào)節(jié)亞單位RI-(，TGF-( RIII，p38 MAP Kinase基因的表達(dá)，而這些基因可參與抑制細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化、誘導(dǎo)細(xì)胞停滯、凋亡等生物學(xué)過程；同時(shí)下調(diào)Zerin，c-myc和cdc25c基因，這些基因與促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程和增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲等活性有關(guān)。上述基因在表達(dá)上的改變可能介導(dǎo)缺失SOCS 盒的ASB-8突變體對SPC-A1細(xì)胞的生長抑制。
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2003
【分類號】：R346

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本文編號：2653720