【摘要】：化學(xué)治療（chemotherapy）是腫瘤主要治療方法之一。在臨床應(yīng)用中可能有2個問題影響療效：化療藥物的毒副作用如骨髓抑制和心肌毒性等以及腫瘤治療過程中發(fā)生的耐藥現(xiàn)象。近年來國內(nèi)外學(xué)者對P-糖蛋白等親脂性藥物轉(zhuǎn)運體蛋白的表達(dá)，活性以及藥物調(diào)節(jié)進(jìn)行了大量研究，為克服腫瘤化療藥物毒性及耐受問題提供了可能性。 P糖蛋白（p-gp）為跨膜糖蛋白，屬于ATP結(jié)合匣轉(zhuǎn)運體超家族。編碼基因稱mdr1。完整p-gp分子含1246個氨基酸殘基；N端和C端構(gòu)成跨膜-胞外區(qū)（分別6次跨膜）；肽鏈中部的氨基酸序列構(gòu)成ATP結(jié)合功能區(qū)，可結(jié)合及水解ATP，為逆濃度梯度轉(zhuǎn)運底物的跨膜運輸提供能量。幾乎全部涉及腫瘤細(xì)胞與p-gp表達(dá)的文獻(xiàn)都指出：通過p-gp轉(zhuǎn)運的底物具有結(jié)構(gòu)和藥理作用多樣性的特點；然而近年已有研究表明p-gp對親脂性分子選擇性結(jié)合，結(jié)合位點可能位于跨膜區(qū)。而其轉(zhuǎn)運底物也不僅限于抗腫瘤藥物，異博定（VRPL）、類固醇等非極性分子都能與p-gp結(jié)合而被其轉(zhuǎn)運。 在多種組織細(xì)胞中，p-gp組成型表達(dá)。這表明p-gp在生理狀態(tài)下也承擔(dān)物質(zhì)轉(zhuǎn)運過程。應(yīng)激性刺激等細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境的改變也可成為p-gp表達(dá)的誘導(dǎo)因素。腫瘤細(xì)胞長期接受化療藥物刺激，p-gp的轉(zhuǎn)錄和翻譯明顯提高，這是發(fā)生所謂多藥耐受（MDR）的原因。此外，細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]增加也是誘導(dǎo)包括mdr-1在內(nèi)的多個活化基因表達(dá)的信號。毒毛旋花子甙K（STPK）通過抑制Na+/K+ATP酶活性而升高細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]，可刺激mdr1的轉(zhuǎn)錄。 本論文的研究內(nèi)容有：（1）以K562、MCF-7和SMM7721細(xì)胞作為反 WP=80 應(yīng)細(xì)胞，分析VRPL和STPK的細(xì)胞增殖調(diào)節(jié)作用以及對p-gp活性和表達(dá)的影響；（2）通過STPK誘導(dǎo)mdr-1表達(dá)，克隆mdr-1編碼序列并構(gòu)建基因疫苗；（3）以mdr1基因疫苗免疫小鼠，觀察特異性血清抗體滴度以及心、肝、腎組織的形態(tài)性。為p-gp生物學(xué)活性研究的深入以及p-gp的調(diào)節(jié)性藥物在臨床上用于糾正p-gp相關(guān)的毒性和耐藥性奠定基礎(chǔ)。 STPK和VRPL對K562細(xì)胞化療藥物敏感性的調(diào)節(jié)作用 采用MTT標(biāo)記細(xì)胞增殖反應(yīng)，觀察STPK和VRPL對傳代腫瘤細(xì)胞系體外增殖的影響以及對柔紅霉素（ADR）敏感性的調(diào)節(jié)作用。 本研究對傳統(tǒng)MTT分析法做了兩點修改：其一，細(xì)胞培養(yǎng)中加入MTT后離心棄去培養(yǎng)的上清部分；其二，僅加入異丙醇溶解MTT代謝后生成的甲佲 沉淀，實驗結(jié)果顯示第一項修改可以大大減低由于培養(yǎng)液顏色改變產(chǎn)生的非特異性背景；第一和第二項修改則明顯提高甲佲 的溶解性。增加了MTT試驗的度量區(qū)間（OD570值域隨細(xì)胞密度不同達(dá)到0~2.0），因此增加了該方法測量細(xì)胞增殖的敏感性。細(xì)胞密度的可測量區(qū)間2×104~20×104。 1、STPK和VPRL的細(xì)胞毒性：在K562、MCF-7和SMMC 7721 3種傳代細(xì)胞系的培養(yǎng)中分別加入0.022~1.4μg/ml STPK或0.25~10μg/ml VRPL，培養(yǎng)時間48hrs，然后加入MTT，檢測細(xì)胞的增殖反應(yīng)是否因不同濃度藥物的存在而表現(xiàn)濃度相關(guān)的抑制作用或稱細(xì)胞毒作用。STPK 0.022~0.35μg/ml，K562細(xì)胞的增殖無明顯改變；兩種貼壁生長的傳代細(xì)胞系在0.088~0.35μg/ml濃度范圍由細(xì)胞增殖表現(xiàn)不同程度抑制（30~40%），但無藥物濃度相關(guān)性。鏡下細(xì)胞貼壁明顯減少。STPK 0.70μg/ml，K562細(xì)胞增殖抑制率達(dá)29.6%，MCF-7和SMMC7721則分別為60.6%和52.3%；而藥物濃度升至1.4μg/ml時，相應(yīng)增至約70%。這說明STPK在0.70μg/ml以上時，3種細(xì)胞呈現(xiàn)細(xì)胞毒反應(yīng)。VRPL 0.25~2.5μg/ml，K562細(xì)胞增殖與對照（藥物濃度=0）相比無變化，但MCF-7和SSMC7721的OD570下降明顯，，藥物濃度超過1μg/ml，細(xì)胞增殖超過50%。因此得出結(jié)論：這兩種藥物對非粘附生長的傳代細(xì)胞體外增殖影響較小，但對粘附生長的腫瘤細(xì) WP=81 胞，則由于干擾細(xì)胞的貼壁而對增殖產(chǎn)生較大的抑制作用。 2、STPK和VRPL改變K562細(xì)胞對ADR的敏感性：ADR是白血病化療治療的常用藥物，在K562細(xì)胞培養(yǎng)中加入倍比稀釋的ADR，最大和最小濃度分別是4μg/ml和0.0625μg/ml。6復(fù)孔平行測量培養(yǎng)24小時的細(xì)胞增殖。對實驗結(jié)果，采用統(tǒng)計學(xué)分析系統(tǒng)軟件包（Statistic Analyses System, SAS）進(jìn)行藥物濃度單因素線性相關(guān)的F檢驗。OD570測量顯示：ADR 2-4μg/ml加入1×105個細(xì)胞的培養(yǎng)中，測量值與未加細(xì)胞的空白對照相同（0.07±0.04）。ADR 0.065μg/ml對K562細(xì)胞增殖無影響，抑制率（％）等于0。ADR 0.0625—2μg/ml，OD570和細(xì)胞增殖抑制率與藥物濃度的自然對數(shù)之間線性相關(guān)（r=0.987, CN=9.728, F=422.7）。 在分析ADR敏感性之前，K562細(xì)胞培養(yǎng)中加入STPK或VRPL（終濃度分別為0.25和2.5μg/ml），37℃ 5%CO2孵育48hrs。進(jìn)行ADR敏感性測定。SAS雙因素（對照及兩種藥物3個分組；每組中0~2μg/mlADR 7種藥物濃度）；線性相關(guān)的Anova檢驗顯示未加藥物預(yù)培養(yǎng)之對照與兩種藥物分別預(yù)處理三組間差別明顯：組間平均平方（MS）1.0347，誤差平均平方0.00514，F(xiàn)=201.3；無藥物預(yù)培養(yǎng)對照ADR IC50 0.21μg/ml，STPK預(yù)培養(yǎng)的K562細(xì)胞ADR IC50 0.37μg/ml, VRPL預(yù)培養(yǎng)者ADR IC50 0.14μg/ml。結(jié)論（1）STPK或VRPL預(yù)培養(yǎng)對K562細(xì)胞增殖無刺激或抑制作用。（2）STPK預(yù)培養(yǎng)降低細(xì)胞對ADR的敏感性。（3）VRPL則增加細(xì)胞
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2004
【分類號】：R392

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本文編號：2652631