【摘要】：化學(xué)治療（chemotherapy）是腫瘤主要治療方法之一。在臨床應(yīng)用中可能有2個(gè)問(wèn)題影響療效：化療藥物的毒副作用如骨髓抑制和心肌毒性等以及腫瘤治療過(guò)程中發(fā)生的耐藥現(xiàn)象。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)P-糖蛋白等親脂性藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白的表達(dá)，活性以及藥物調(diào)節(jié)進(jìn)行了大量研究，為克服腫瘤化療藥物毒性及耐受問(wèn)題提供了可能性。 P糖蛋白（p-gp）為跨膜糖蛋白，屬于ATP結(jié)合匣轉(zhuǎn)運(yùn)體超家族。編碼基因稱mdr1。完整p-gp分子含1246個(gè)氨基酸殘基；N端和C端構(gòu)成跨膜-胞外區(qū)（分別6次跨膜）；肽鏈中部的氨基酸序列構(gòu)成ATP結(jié)合功能區(qū)，可結(jié)合及水解ATP，為逆濃度梯度轉(zhuǎn)運(yùn)底物的跨膜運(yùn)輸提供能量。幾乎全部涉及腫瘤細(xì)胞與p-gp表達(dá)的文獻(xiàn)都指出：通過(guò)p-gp轉(zhuǎn)運(yùn)的底物具有結(jié)構(gòu)和藥理作用多樣性的特點(diǎn)；然而近年已有研究表明p-gp對(duì)親脂性分子選擇性結(jié)合，結(jié)合位點(diǎn)可能位于跨膜區(qū)。而其轉(zhuǎn)運(yùn)底物也不僅限于抗腫瘤藥物，異博定（VRPL）、類固醇等非極性分子都能與p-gp結(jié)合而被其轉(zhuǎn)運(yùn)。 在多種組織細(xì)胞中，p-gp組成型表達(dá)。這表明p-gp在生理狀態(tài)下也承擔(dān)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程。應(yīng)激性刺激等細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境的改變也可成為p-gp表達(dá)的誘導(dǎo)因素。腫瘤細(xì)胞長(zhǎng)期接受化療藥物刺激，p-gp的轉(zhuǎn)錄和翻譯明顯提高，這是發(fā)生所謂多藥耐受（MDR）的原因。此外，細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]增加也是誘導(dǎo)包括mdr-1在內(nèi)的多個(gè)活化基因表達(dá)的信號(hào)。毒毛旋花子甙K（STPK）通過(guò)抑制Na+/K+ATP酶活性而升高細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]，可刺激mdr1的轉(zhuǎn)錄。 本論文的研究?jī)?nèi)容有：（1）以K562、MCF-7和SMM7721細(xì)胞作為反 WP=80 應(yīng)細(xì)胞，分析VRPL和STPK的細(xì)胞增殖調(diào)節(jié)作用以及對(duì)p-gp活性和表達(dá)的影響；（2）通過(guò)STPK誘導(dǎo)mdr-1表達(dá)，克隆mdr-1編碼序列并構(gòu)建基因疫苗；（3）以mdr1基因疫苗免疫小鼠，觀察特異性血清抗體滴度以及心、肝、腎組織的形態(tài)性。為p-gp生物學(xué)活性研究的深入以及p-gp的調(diào)節(jié)性藥物在臨床上用于糾正p-gp相關(guān)的毒性和耐藥性奠定基礎(chǔ)。 STPK和VRPL對(duì)K562細(xì)胞化療藥物敏感性的調(diào)節(jié)作用 采用MTT標(biāo)記細(xì)胞增殖反應(yīng)，觀察STPK和VRPL對(duì)傳代腫瘤細(xì)胞系體外增殖的影響以及對(duì)柔紅霉素（ADR）敏感性的調(diào)節(jié)作用。 本研究對(duì)傳統(tǒng)MTT分析法做了兩點(diǎn)修改：其一，細(xì)胞培養(yǎng)中加入MTT后離心棄去培養(yǎng)的上清部分；其二，僅加入異丙醇溶解MTT代謝后生成的甲佲 沉淀，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示第一項(xiàng)修改可以大大減低由于培養(yǎng)液顏色改變產(chǎn)生的非特異性背景；第一和第二項(xiàng)修改則明顯提高甲佲 的溶解性。增加了MTT試驗(yàn)的度量區(qū)間（OD570值域隨細(xì)胞密度不同達(dá)到0~2.0），因此增加了該方法測(cè)量細(xì)胞增殖的敏感性。細(xì)胞密度的可測(cè)量區(qū)間2×104~20×104。 1、STPK和VPRL的細(xì)胞毒性：在K562、MCF-7和SMMC 7721 3種傳代細(xì)胞系的培養(yǎng)中分別加入0.022~1.4μg/ml STPK或0.25~10μg/ml VRPL，培養(yǎng)時(shí)間48hrs，然后加入MTT，檢測(cè)細(xì)胞的增殖反應(yīng)是否因不同濃度藥物的存在而表現(xiàn)濃度相關(guān)的抑制作用或稱細(xì)胞毒作用。STPK 0.022~0.35μg/ml，K562細(xì)胞的增殖無(wú)明顯改變；兩種貼壁生長(zhǎng)的傳代細(xì)胞系在0.088~0.35μg/ml濃度范圍由細(xì)胞增殖表現(xiàn)不同程度抑制（30~40%），但無(wú)藥物濃度相關(guān)性。鏡下細(xì)胞貼壁明顯減少。STPK 0.70μg/ml，K562細(xì)胞增殖抑制率達(dá)29.6%，MCF-7和SMMC7721則分別為60.6%和52.3%；而藥物濃度升至1.4μg/ml時(shí)，相應(yīng)增至約70%。這說(shuō)明STPK在0.70μg/ml以上時(shí)，3種細(xì)胞呈現(xiàn)細(xì)胞毒反應(yīng)。VRPL 0.25~2.5μg/ml，K562細(xì)胞增殖與對(duì)照（藥物濃度=0）相比無(wú)變化，但MCF-7和SSMC7721的OD570下降明顯，，藥物濃度超過(guò)1μg/ml，細(xì)胞增殖超過(guò)50%。因此得出結(jié)論：這兩種藥物對(duì)非粘附生長(zhǎng)的傳代細(xì)胞體外增殖影響較小，但對(duì)粘附生長(zhǎng)的腫瘤細(xì) WP=81 胞，則由于干擾細(xì)胞的貼壁而對(duì)增殖產(chǎn)生較大的抑制作用。 2、STPK和VRPL改變K562細(xì)胞對(duì)ADR的敏感性：ADR是白血病化療治療的常用藥物，在K562細(xì)胞培養(yǎng)中加入倍比稀釋的ADR，最大和最小濃度分別是4μg/ml和0.0625μg/ml。6復(fù)孔平行測(cè)量培養(yǎng)24小時(shí)的細(xì)胞增殖。對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用統(tǒng)計(jì)學(xué)分析系統(tǒng)軟件包（Statistic Analyses System, SAS）進(jìn)行藥物濃度單因素線性相關(guān)的F檢驗(yàn)。OD570測(cè)量顯示：ADR 2-4μg/ml加入1×105個(gè)細(xì)胞的培養(yǎng)中，測(cè)量值與未加細(xì)胞的空白對(duì)照相同（0.07±0.04）。ADR 0.065μg/ml對(duì)K562細(xì)胞增殖無(wú)影響，抑制率（％）等于0。ADR 0.0625—2μg/ml，OD570和細(xì)胞增殖抑制率與藥物濃度的自然對(duì)數(shù)之間線性相關(guān)（r=0.987, CN=9.728, F=422.7）。 在分析ADR敏感性之前，K562細(xì)胞培養(yǎng)中加入STPK或VRPL（終濃度分別為0.25和2.5μg/ml），37℃ 5%CO2孵育48hrs。進(jìn)行ADR敏感性測(cè)定。SAS雙因素（對(duì)照及兩種藥物3個(gè)分組；每組中0~2μg/mlADR 7種藥物濃度）；線性相關(guān)的Anova檢驗(yàn)顯示未加藥物預(yù)培養(yǎng)之對(duì)照與兩種藥物分別預(yù)處理三組間差別明顯：組間平均平方（MS）1.0347，誤差平均平方0.00514，F(xiàn)=201.3；無(wú)藥物預(yù)培養(yǎng)對(duì)照ADR IC50 0.21μg/ml，STPK預(yù)培養(yǎng)的K562細(xì)胞ADR IC50 0.37μg/ml, VRPL預(yù)培養(yǎng)者ADR IC50 0.14μg/ml。結(jié)論（1）STPK或VRPL預(yù)培養(yǎng)對(duì)K562細(xì)胞增殖無(wú)刺激或抑制作用。（2）STPK預(yù)培養(yǎng)降低細(xì)胞對(duì)ADR的敏感性。（3）VRPL則增加細(xì)胞
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2004
【分類號(hào)】：R392

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本文編號(hào)：2652631