【摘要】：丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus, HCV)在全球范圍內(nèi)感染約1.7億人,每年新發(fā)HCV感染病例約3.5萬(wàn)例。HCV感染不僅可以引起急性和慢性肝炎,而且還可能發(fā)展成為肝硬化和肝癌等,對(duì)感染者的健康和生命危害極大。目前針對(duì)慢性丙型肝炎的治療手段非常有限,而且不具備廣譜性。因此,深入研究HCV在體內(nèi)的復(fù)制與傳播的分子機(jī)制以提供更加有效的治療手段勢(shì)在必行。 HCV是單鏈正義RNA病毒,屬于黃病毒科。它的基因組編碼一個(gè)約3000個(gè)氨基酸的多聚蛋白前體,該多聚蛋白在細(xì)胞以及病毒自身蛋白酶的作用下形成成熟的結(jié)構(gòu)蛋白(Core、E1和E2)以及非結(jié)構(gòu)蛋白(p7、NS2、NS3、NS4A、 NS4B、NS5A和NS5B)。其中NS5A是HCV復(fù)制和組裝的關(guān)鍵蛋白,不具備蛋白酶活性,其N端含有一個(gè)負(fù)責(zé)膜錨定的α螺旋。它在細(xì)胞中以多種磷酸化的形式存在,可與大量的宿主蛋白相互作用,比如FK506-binding protein8(FKBP8)和vesicle-associated membrane protein-associated protein A (VAP-A,也稱作hVAP-33),從而影響細(xì)胞的多種正常生理功能,包括細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖以及免疫反應(yīng)等。 有研究人員以HCV的各個(gè)蛋白作為誘餌,在人類cDNA文庫(kù)中高通量篩選與其相互作用蛋白,發(fā)現(xiàn)GPS2(G protein pathway suppressor2)能與HCV NS5A蛋白相互作用。GPS2在多種組織細(xì)胞中均有表達(dá),GPS2蛋白在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中均有定位,細(xì)胞核中的GPS2蛋白能夠與某些轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子如細(xì)胞核受體共抑制復(fù)合物(NCoR/SMRT)相互作用,從而調(diào)控基因的表達(dá)。有研究發(fā)現(xiàn),定位于細(xì)胞質(zhì)中的GPS2蛋白能夠調(diào)控促炎癥因子TNF-α的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。關(guān)于GPS2蛋白與HCV復(fù)制間的關(guān)系尚未見(jiàn)報(bào)道。我們首先在過(guò)量表達(dá)和生理感染HCV的系統(tǒng)中,通過(guò)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了GPS2蛋白與HCV NS5A蛋白之間的相互作用。然后我們構(gòu)建了GPS2和NS5A的各個(gè)結(jié)構(gòu)域的截短突變體表達(dá)載體,通過(guò)過(guò)表達(dá)的免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)NS5A的結(jié)構(gòu)域Ⅰ以及GPS2的coiled-coil結(jié)構(gòu)域?yàn)閮烧呦嗷プ饔盟匦�。在此基礎(chǔ)上,我們又構(gòu)建了GPS2的knockdown表達(dá)載體,利用逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝的RNA干擾實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)GPS2在HCV的復(fù)制過(guò)程中起到非常重要的作用,是HCV復(fù)制不可缺少的一個(gè)功能蛋白。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn),GPS2對(duì)于NS5A招募宿主因子VAP-A是必需的。已有的研究表明,NS5A與VAP-A間的相互作用對(duì)于HCV病毒復(fù)制復(fù)合體的形成以及病毒的復(fù)制至關(guān)重要。我們發(fā)現(xiàn),在細(xì)胞中過(guò)量表達(dá)GPS2可以顯著增強(qiáng)NS5A與VAP-A之間的相互作用,而下調(diào)細(xì)胞內(nèi)GPS2的表達(dá)則會(huì)破壞兩者間的相互作用。這表明GPS2很可能是NS5A與VAP-A之間相互作用的“橋梁”,促進(jìn)NS5A招募VAP-A,從而利于病毒的復(fù)制。
【學(xué)位授予單位】：武漢大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R373.21

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2652017