【摘要】：干細胞在細胞治療、再生醫(yī)學(xué)和癌癥研究方面的臨床應(yīng)用前景和意義已被全世界所公知，但其在倫理道德、分化潛能、免疫排斥和安全性等方面尚存亟待解決的問題，而干細胞機理研究作為實現(xiàn)可控增殖與分化、降低免疫排斥和避免成瘤的基礎(chǔ)研究，已引起越來越高的重視。微流控芯片以其所具備的獨特優(yōu)勢，能夠在幾微米至幾百微米尺度下實現(xiàn)對細胞的操縱控制，從而實現(xiàn)干細胞在可控微環(huán)境/小生境下的可控增殖與分化，是干細胞機理研究不可替代的手段之一。目前使用微流控芯片研究干細胞的工作剛剛起步，領(lǐng)域內(nèi)的參考文獻尚少，雖已取得了一些研究成果，但還未能形成統(tǒng)一、高效、穩(wěn)定地在微流控芯片上操縱和培養(yǎng)干細胞的方法。本論文試圖通過自行設(shè)計并制備的一種微流控芯片，，來探索在微流控芯片上操縱控制干細胞的方法，并探索干細胞在微流控芯片上的培養(yǎng)方法。 本論文從設(shè)計、制備和應(yīng)用等方面對干細胞微流控芯片進行了研究，并針對在微流控芯片中干細胞需要進行呼吸作用、剪切力會對干細胞產(chǎn)生影響、制備過程中芯片材料的選擇、制備效率的提高和成本的降低、微流控芯片易用性的提高、干細胞注入微流控芯片、干細胞在微流控芯片中的培養(yǎng)等問題進行了探索。 在設(shè)計方面，本論文詳細分析了干細胞在非芯片條件下培養(yǎng)的7個基本條件，并探討了這7個基本條件在微流控芯片培養(yǎng)條件下實現(xiàn)的方法；考慮到微流控芯片培養(yǎng)條件對干細胞的影響以及在微流控芯片上操縱干細胞和培養(yǎng)干細胞對芯片結(jié)構(gòu)的要求等因素，對微流控芯片的芯片結(jié)構(gòu)進行了總體設(shè)計，并利用有限元分析軟件對氣室區(qū)和培養(yǎng)區(qū)進行了優(yōu)化設(shè)計。結(jié)果表明：當氣室結(jié)構(gòu)中入口和出口的距離越長時，氣室中流速較小部分所占比例越小，流速相對較大部分所占比例越大，越有利于迅速換氣并減少氣體殘留，并且這一規(guī)律與入口、出口和氣室三者的位置關(guān)系無關(guān)；通過理論計算可以得出，在常用電動微量注射裝置驅(qū)動的微流控芯片中，當培養(yǎng)室直徑在1mm量級上時，干細胞所受剪切力在10-2dynes/cm2量級上，并且這一量級上的剪切力遠遠小于已有報道的會對干細胞產(chǎn)生影響的平均剪切力值。 在制備方面，本論文簡單介紹了制備微流控芯片的材料、方法和流程，并介紹了常見的加工、鍵合、封裝和檢測技術(shù)；對微流控芯片在制備過程中，在芯片材料的選擇、制備效率和成本、易用性等方面存在的問題進行了分析，并針對這些問題進行了研究。在微結(jié)構(gòu)的加工過程中，采用光盤壓印的方法進行加工；在基板和蓋片的鍵合過程中，采用熱壓鍵合的方法進行；在微流控芯片的封裝過程中，采用微針連接微流控芯片和外部設(shè)備；并分別對加工效率、鍵合效率和封裝效率進行了估算。結(jié)果表明：PC材料最適合作為干細胞微流控芯片的制備材料；通過再鍵合，可以提高鍵合效率，從而提高了微流控芯片的制備效率并降低了制備成本；通過微針連接微流控芯片和外部設(shè)備，可以實現(xiàn)微流控芯片中微觀結(jié)構(gòu)與外部設(shè)備中宏觀結(jié)構(gòu)的連接，解決微流控芯片微觀結(jié)構(gòu)與外部宏觀接口不匹配、難于封裝的問題，并提高微流控芯片的易用性。 在應(yīng)用方面，本論文選用ICR小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞作為實驗細胞；并且選用低溫濕法滅菌作為微流控芯片的滅菌處理方法；為方便實驗操作，設(shè)計了一套手動微量注射裝置。利用微量注射裝置，將單細胞和多個細胞注入到微流控芯片中，并與非芯片條件下剛剛完成接種還未貼壁的細胞進行了對比。同時，為了驗證微流控芯片氣室區(qū)和培養(yǎng)區(qū)的優(yōu)化結(jié)果與實際情況是否相符，選用單細胞作為微流控芯片中液體流速的標記物，對單細胞移動速度進行了測量，并將所得測量值與同等條件下液體流速的計算值進行了對比。此外，在將單細胞和多個細胞注入到微流控芯片中以后，還對單細胞和多個細胞進行了培養(yǎng)，并與非芯片條件下培養(yǎng)的細胞進行了對比。結(jié)果表明：注入后，微流控芯片中和非芯片條件下的細胞形態(tài)一致；單細胞移動速度的測量值與液體流速的計算值基本一致，驗證了對微流控芯片氣室區(qū)和培養(yǎng)區(qū)進行優(yōu)化所得出的結(jié)果；培養(yǎng)中，微流控芯片中和非芯片條件下的細胞形態(tài)一致；微流控芯片中有限的培養(yǎng)面積可能抑制了ICR小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞的增殖，并且這種對細胞增殖的抑制或促進作用可能與細胞種類有關(guān)。
【圖文】：

細胞芯片這一領(lǐng)域內(nèi)的研究眾多，所涉及的細胞種類多種多樣，所采取的芯片結(jié)構(gòu)也不盡相同，但從芯片功能上看，大致可分為如下六種功能單元，如圖 1-1 所示[50]：（1）培養(yǎng) 培養(yǎng)單個或多個細胞 例如：單細胞培養(yǎng)[69]、多細胞培養(yǎng)（如圖1-1 a 和圖 1-1 b 所示）、多細胞計數(shù)（如圖 1-1 a 所示）、培養(yǎng)監(jiān)控[70]、分化監(jiān)控[71]、培養(yǎng)環(huán)境控制[72]和分化環(huán)境控制[73]等；（2）處理 對細胞進行操作 例如：層流對細胞的影響（如圖 1-1 c 所示）、細胞的液體動力驅(qū)動（如圖 1-1 d 所示）、光鑷操縱[74]、電操縱[75]和磁操縱[76]等；（3）篩選 取得所需的細胞 例如：單細胞電泳（如圖 1-1 e 所示）、微流式細胞儀（如圖 1-1 f 所示）、光鑷篩選[74]和電動力學(xué)篩選[77]等；（4）溶解 將細胞內(nèi)物質(zhì)從細胞壁中釋放出來 例如：機械微刀（如圖 1-1 g所示）和細胞電溶解（如圖 1-1 h）等；（5）分離 取得所需的細胞內(nèi)物質(zhì) 例如：溶解產(chǎn)物中細胞器的等電點聚焦（如圖 1-1 i 所示）、蛋白質(zhì)分離（如圖 1-1 j）、電泳分離[78]等；（6）分析 對細胞或細胞內(nèi)物質(zhì)進行分析 例如：免疫熒光檢測（如圖 1-1 k所示）、中空懸臂質(zhì)譜檢測（如圖 1-1 1）和微流式細胞儀[79, 80]等。1.2 文獻評述1.2.1 干細胞微陣列芯片干細胞微陣列芯片的結(jié)構(gòu)形式主要分為有兩種：點樣式和微井式。點樣式芯片相比微井式芯片具有基底表面為平面、實驗中需要使用點樣儀加樣的特點

點樣式芯片中各種材料的選擇需要考慮以下幾方面的因素：細胞接觸材料（圖1-2 中的藻朊酸鹽）對細胞的無毒性、相互接觸材料間（圖 1-2 中的藻朊酸鹽與氯化鋇/多聚賴氨酸、氯化鋇/多聚賴氨酸與聚（苯乙烯-co-順丁烯酸酐）、聚（苯乙烯-co-順丁烯酸酐）與載玻片材料）需要較大的相親性和細胞接觸材料（圖 1-2中的藻朊酸鹽）與襯底材料（圖 1-2 中的聚（苯乙烯-co-順丁烯酸酐））間的相疏性等。圖 1-3 展示了一個利用點樣式芯片進行藥物毒性研究的示例[37, 81]。在示例中，Moo-Yeal Lee 等人利用 9 種藥物和細胞色素 P450 及其代謝產(chǎn)物的組合，對人類乳腺癌細胞的抑制作用進行了檢測，得出了了 9 種藥物對人類乳腺癌細胞的半抑制率（IC50）[81]。這 9 種藥物是：乙酰水楊酸/阿司匹林、三苯氧胺/它莫西培養(yǎng) 處理 篩選溶解 分離 分析培養(yǎng) 處理 篩選 溶解 分離分析圖 1-1 細胞芯片上的反應(yīng)Fig. 1-1 Reactions on cell chips
【學(xué)位授予單位】：北京工業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：TN492;R329.2

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本文編號：2647827