【摘要】：睪丸作為主要的男性性腺器官,其主要功能是產(chǎn)生精子和分泌雄激素。精子發(fā)生是從未分化的生精細(xì)胞發(fā)育至精子的過程,其中包含了精原干細(xì)胞的有絲分裂,精母細(xì)胞經(jīng)減數(shù)分裂產(chǎn)生單倍體的圓形精子細(xì)胞以及后續(xù)的圓形精子細(xì)胞向精子轉(zhuǎn)變的精子變形過程。這些嚴(yán)格而復(fù)雜的程序化過程需要多種基因和蛋白質(zhì)在不同發(fā)育時相精確協(xié)調(diào)地表達(dá)和調(diào)控,并且睪丸中很多蛋白表達(dá)都在翻譯水平受到調(diào)節(jié),為了更好的理解人睪丸的功能,在整體水平上對睪丸蛋白質(zhì)表達(dá)譜進(jìn)行鑒定并對其翻譯調(diào)節(jié)進(jìn)行研究有著重要的意義。 我們使用一維瓊脂糖凝膠電泳結(jié)合液相色譜分離后高級LTQ Orbitrap質(zhì)譜鑒定的策略構(gòu)建了人睪丸蛋白表達(dá)譜,共鑒定1430中蛋白質(zhì),其中有39個是睪丸特異表達(dá)的。對鑒定的睪丸蛋白表達(dá)譜進(jìn)行結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)有三個大的蛋白家族:RRM蛋白家族、Rab蛋白家族和Arf蛋白家族。對RRM蛋白家族的通路注釋顯示該家族很多蛋白能調(diào)節(jié)剪接過程,它們可能與睪丸特異剪接的產(chǎn)生有關(guān)。對Rab和Arf兩個蛋白家族的通路注釋顯示兩者均與囊泡事件相關(guān),可能參與頂體反應(yīng)過程。另外,與腦組織表達(dá)的蛋白相比人睪丸蛋白表達(dá)譜中蛋白的研究相對比較局限,對睪丸蛋白表達(dá)譜中這些蛋白的深入研究可以幫助更好的理解睪丸功能。 為了更好的研究精子發(fā)生,我們進(jìn)一步構(gòu)建了純化的生精細(xì)胞的表達(dá)譜,由于人標(biāo)本的限制,我們選擇了最常用于研究精子發(fā)生的哺乳動物小鼠,使用流式細(xì)胞儀分別純化了小鼠睪丸DNA含量分別為1C的單倍體生精細(xì)胞(1C生精細(xì)胞,精子細(xì)胞/精子)和4C的生精細(xì)胞(4C生精細(xì)胞),使用人睪丸譜系構(gòu)建相似的策略構(gòu)建了含有2116種蛋白的精子變形相關(guān)的精子細(xì)胞/精子蛋白表達(dá)譜和含有3507種蛋白的主要與第一次減數(shù)相關(guān)的4C生精細(xì)胞蛋白表達(dá)譜。 在小鼠睪丸精子細(xì)胞/精子蛋白表達(dá)譜中有299個睪丸特異蛋白和157種新蛋白。對這些蛋白功能的生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)很多蛋白可能參與精子變形過程中的特異事件。對4C生精細(xì)胞蛋白表達(dá)譜的生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)表達(dá)譜中有216個蛋白是酵母減數(shù)分裂蛋白的同源蛋白,它們參與粗線期、DNA重組等細(xì)胞周期的各個事件,相互作用分析顯示這些蛋白之間有復(fù)雜的調(diào)控關(guān)系。對兩個表達(dá)譜的染色體定位分析顯示蛋白在X染色體上分布均很少,可能是由于減數(shù)分裂后性染色體失活導(dǎo)致。兩個表達(dá)譜的比較分析發(fā)現(xiàn)大部分精子細(xì)胞/精子中表達(dá)的蛋白在4C生精細(xì)胞階段就已經(jīng)開始翻譯,這些蛋白中睪丸特異表達(dá)的主要與雄性配子發(fā)生相關(guān)。另外,只在4C生精細(xì)胞階段鑒定到的蛋白主要與細(xì)胞周期相關(guān),可能參與減數(shù)分裂調(diào)控,而只在精子細(xì)胞/精子階段鑒定到的蛋白則主要與精子變形中明顯的結(jié)構(gòu)改變等事件有關(guān)。 睪丸中蛋白表達(dá)有明顯的翻譯抑制現(xiàn)象,而最近很受關(guān)注的非編碼小RNA家族的成員microRNA能通過多種機(jī)制調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的翻譯。通過分析哺乳動物全基因組microRNA的分布與進(jìn)化,我們發(fā)現(xiàn)睪丸表達(dá)的成熟microRNA在X染色體上的進(jìn)化速度快于常染色體。睪丸成熟的X連鎖microRNA在小鼠和人之間的平均堿基替換速率大約是常染色體睪丸microRNA的25倍,而前體不在睪丸表達(dá)的成熟microRNA的堿基替換速率在常染色體和X染色體之間則沒有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異。另外,睪丸表達(dá)的前體microRNA在X染色體上的進(jìn)化速度也是快于常染色體的,這種睪丸表達(dá)的X連鎖microRNA的快速進(jìn)化現(xiàn)象廣泛存在于包括嚙齒類動物和靈長類動物動物在內(nèi)的哺乳動物中。對睪丸表達(dá)X連鎖microRNA靶基因的功能分析顯示這些microRNA可能在精原細(xì)胞的有絲分裂和/或精母細(xì)胞的減數(shù)分裂過程中發(fā)揮著重要的作用,調(diào)節(jié)人睪丸蛋白表達(dá)譜中細(xì)胞周期相關(guān)蛋白,從而調(diào)節(jié)精子發(fā)生。 我們對于人睪丸和小鼠生精細(xì)胞蛋白表達(dá)譜的大規(guī)模構(gòu)建能夠為將來研究男性不育,尋找可能的避孕靶點(diǎn),以及發(fā)展睪丸癌治療新方法提供一個非常豐富的資源。而對于睪丸表達(dá)microRNA的功能分析提示其在睪丸功能調(diào)節(jié)中可能有非常重要的作用,深入的研究能幫助闡釋睪丸中蛋白的翻譯抑制現(xiàn)象和更好的進(jìn)行睪丸蛋白水平的研究。
【圖文】：

南京醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文IPI00246975 GSTM3 2947 Glutathione S-transferase Mu 3IPI00304814 GPX4 2879Isoform Mitochondrial of Phospholipid hydroperoxideglutathione peroxidase, mitochondrial precursorIPI00020602 CSNK2A2 1459 Casein kinase II subunit alpha'IPI00031758 CHKB 1120 Choline/ethanolamine kinaseIPI00788782 ATP1A3 478 Na+/K+-ATPase alpha 3 subunit variant3. 人睪丸蛋白表達(dá)譜的 gene ontology 注釋。我們使用 DAVID 軟件[30]對鑒定的蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析。圖 1 中顯示的是鑒定蛋白的亞細(xì)胞分布，蛋白最多的定位是胞漿（27%），其次是未知細(xì)胞定位（16%），接下來是膜（14%）和核 (13%)。有些蛋白定位于細(xì)胞器，比如線粒體（7%），內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（4%），，高爾基體（3%）和溶酶體（1%）。博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 2011年 第12期 醫(yī)藥衛(wèi)生科技輯 E059-

23圖 2. Pathway Studio 注釋的被含有 RRM 結(jié)構(gòu)域蛋白調(diào)節(jié)的細(xì)胞過程。橢圓形的為蛋白，方形的為被調(diào)節(jié)的細(xì)胞過程。蛋白與細(xì)胞過程間的調(diào)節(jié)關(guān)系用箭頭表示，這些調(diào)節(jié)關(guān)系均是有參考文獻(xiàn)支持的。
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號】：R341

【共引文獻(xiàn)】

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10 應(yīng)一平;斑

本文編號：2645383