【摘要】：肝臟由胚胎內(nèi)胚層演變而來(lái)，胚胎期肝具有重要的造血功能。人胚6周，造血干細(xì)胞(hematopoietic stem cell，HSC)從卵黃囊遷入肝，即進(jìn)入了肝臟造血期。胎兒15～24周，是肝造血的旺盛期。胎肝造血以紅細(xì)胞系占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，也有粒細(xì)胞系不同發(fā)育階段的細(xì)胞，還有淋巴細(xì)胞和巨核細(xì)胞。紅細(xì)胞系中以中幼紅細(xì)胞的數(shù)量最多，粒細(xì)胞系數(shù)量少，出現(xiàn)也晚。至胚胎6月肝臟造血逐漸減弱，到出生時(shí)由骨髓造血所取代。 胃腸道內(nèi)分泌細(xì)胞分泌的血管活性多肽(Vasoactive Intestinal peptide，VIP)具有多種生物學(xué)功能，當(dāng)其隨門(mén)靜脈血流進(jìn)入肝臟后，與肝細(xì)胞上的相應(yīng)受體結(jié)合，內(nèi)在化后被溶酶體降解，很快被清除。因此，肝臟是滅活VIP的主要場(chǎng)所。肝臟局部的VIP及受體對(duì)肝臟造血及造血器官的遷移起了何種作用?對(duì)造血干細(xì)胞在肝臟的橫向分化有何影響也令人感興趣。為回答以上問(wèn)題，我們探討了VIP對(duì)造血干細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及機(jī)制。 目的 1．探討VIP對(duì)人HSC體外增殖及集落形成的影響，以及可能機(jī)制； 2．VIP對(duì)人HSC向造血系細(xì)胞分化的影響； 3．VIP對(duì)人HSC向肝系分化的影響及可能機(jī)制，解釋VIP對(duì)HSC橫向分化的可能影響； 4．通過(guò)胎肝發(fā)育中VIP及VIPR含量的變化，初探胎肝造血轉(zhuǎn)移機(jī)制； 5．VIP是否通過(guò)HSC上的相應(yīng)受體介導(dǎo)發(fā)揮上述作用，HSC上VIP受體為何種亞型? 重慶醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文 方法 1.采集人臍血標(biāo)本，淋巴細(xì)胞分離液分離出單個(gè)核細(xì)胞; 2.免疫磁分選技術(shù)純化人臍血CD34十細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)鑒定純度; 3.體外集落形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)V正對(duì)人HSC集落形成能力的影響; 4.擴(kuò)增培養(yǎng)計(jì)數(shù)VIP對(duì)CD34+細(xì)胞增殖影響; 5.酶聯(lián)免疫化學(xué)法測(cè)定培養(yǎng)HSC細(xì)胞及上清TNF-a、TGF-B水平，以及A萬(wàn)P水 平; 6.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD34+細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中各系分化細(xì)胞比例; 7.免疫組織化學(xué)法檢測(cè) HSC上肝系標(biāo)志AFP、ALB、CK-19的表達(dá); 8·Westem blot方法檢測(cè)Hse上ALB表達(dá); 9.巢式RpPCR方法檢測(cè)HSC上AFP、ALB的mRNA表達(dá)，隨機(jī)選送ALB產(chǎn) 物測(cè)序; 10.采集發(fā)育不同期SD大鼠肝臟標(biāo)本; 11.生物分子相互作用系統(tǒng)(Biacore)測(cè)定人HSC、肝臟組織vIPR結(jié)合力; 12.放射免疫法檢測(cè)肝臟組織VIP濃度水平; 13.Rl’- PCR方法檢測(cè)人HSC、肝臟組織VIPR的mRNA表達(dá)。 結(jié)果 1.vIP在10一7m。呱一10一‘2 mof幾濃度范圍內(nèi)可抑制造血干細(xì)胞集落形成(抑制率 )26.97士13.72%)，P0.05;在10一8 mol/L抑制作用最大。10·8 moULv護(hù)作用 下HSC擴(kuò)增倍數(shù)第7、10、14天分別依次為1 1 .78士4.39、16.71士2.98、21.69 士3.28倍，顯著低于對(duì)照組(20.13士3.32、25.64士3.51、25.33士2.61)，P0.05。 2.vIP作用于HSC后，細(xì)胞內(nèi)TNF一a濃度為149.15p創(chuàng)ml，較對(duì)照組顯著升高， P0.05，增加T 49%;V正顯著增加T HSC內(nèi)TGF一B，濃度，為116.lop歲ml， 較對(duì)照組升高44.41%，P0·05。 重慶醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文 3.1護(hù)mo呱的v正作用Hse 14天后，粒系eD13細(xì)胞比例為50.33%，對(duì)照組 為93.35%，有顯著降低，P0.05;7天組、14天組單核系CD14細(xì)胞比例分別 依次為8.20%和15.巧%，對(duì)照組分別依次為13.80%和22.55%，也有顯著降低， P0.05。紅系CD71+細(xì)胞、巨核系CD41+細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞CD19+細(xì)胞、T淋 巴細(xì)胞CD4/CDS細(xì)胞、祖細(xì)胞CD33+細(xì)胞在VIP作用前后均無(wú)顯著性差異， p0.05。v正作用于CD34細(xì)胞7天后，CD34+細(xì)胞比例較對(duì)照組(18.乃%)明顯 增加(22.0%)，P0.050 4.免疫組化結(jié)果顯示人HSC上不表達(dá)CK一19蛋白，但有ArP和ALB蛋白表達(dá); VIP作用HSC 14天后，HSC內(nèi)的AFp濃度(165士8.51 Pg/ml)較對(duì)照組(270土 11.37p留ml)顯著下降，P0.05。western blot顯示v正作用后Hse內(nèi)ALB蛋 白表達(dá)有減弱趨勢(shì)。人臍血單個(gè)核細(xì)胞和CD34+細(xì)胞都表達(dá)了AFP mRNA和 A工B mRNA，隨機(jī)選取ALB產(chǎn)物測(cè)序與Genebank中ALB基因序列完全相同。 5.從胚胎到新生鼠，肝臟vIP量(分別為1349.18士220.37n歲加l，2439.64士394.22 ng/ml)與V正受體表達(dá)量(分別為806.67士58.47 RU/ug蛋白，952.5士121.45 RU/ug蛋白)均呈增加趨勢(shì);出生后，從未成年期到成年期肝臟vIP量(分別為 2689·47士227·53ng/ml，1911.79士453.15 ng/ml)與V護(hù)受體表達(dá)量(分別為 762.5士97.15 RU加g蛋白，425士119.38 RU/ug蛋白)都逐漸降低，即出生前后 呈相反的變化趨勢(shì)。值得注意的是，新生期VIP量低于未成年期，但VIP受 體表達(dá)量卻正相反。Rl’- PCR顯示大鼠發(fā)育不同時(shí)期肝臟都表達(dá)VIP受體1型。 6.生物分子相互作用系統(tǒng)顯示人造血干細(xì)胞表達(dá) vIPR，結(jié)合量為2366.67 RU枷g 蛋白;Rl’- PCR顯示人臍血造血干細(xì)胞和單個(gè)核細(xì)胞表達(dá)V正R一1 mRNA。 結(jié)論 1.VIP可抑制人造血干細(xì)胞增殖和集落形成，是一種新被認(rèn)識(shí)的造血抑制劑。 2.V砰抑制人造血干細(xì)胞增殖的機(jī)制之一是通過(guò)上調(diào)HSC內(nèi)造血抑制因子 TNF一a、TGF一B水平實(shí)現(xiàn)的。 重慶醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文 3.VIP抑制造血干細(xì)胞向粒單系分化，對(duì)其向紅系及其它系分化無(wú)影響;VIP從 時(shí)間上減緩CD34抗原消失，
【圖文】：

10987VIP(一Logmo比)圖3一IV正對(duì)HSC集落形成影響Fig.3一1TheeffectofV護(hù)onCFUonHSC二、VIP對(duì)HSC增殖的影響液體培養(yǎng)體系中，HSC顯示出較強(qiáng)的擴(kuò)增潛能，但viPl0’sm叮L作用下，，其增殖能力與對(duì)照組相比較被顯著抑制。viP10一smol幾作用HSC7天、10天、14天擴(kuò)增倍數(shù)分別依次為n.78士4.39、16.71士2.98、21.69士3.28，對(duì)照組擴(kuò)增倍數(shù)分別依次為20.13士3.32、25.64士3.81、28.33士2.61，二者相比較有顯著性差異(P<0.05)。圖3一2

HSC及CFU倒置顯微鏡下形態(tài)
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2004
【分類(lèi)號(hào)】：R329.2

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 張占英,鐘宏良,朱固,張瀾生,梁誠(chéng),張金龍,諸雪珍;一種富集臍血造血干/祖細(xì)胞的簡(jiǎn)易方法[J];蘇州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);1998年12期

2 裴雪濤,王立生,徐黎,吳祖澤;臍血 CD_(34)~+ 細(xì)胞擴(kuò)增和改善其移植效率的實(shí)驗(yàn)研究[J];中華血液學(xué)雜志;1997年03期

3 裴雪濤,王立生,徐黎,馮凱,李梁,龍紅,吳祖澤;CD_(34)~+造血祖細(xì)胞的定向誘導(dǎo)分化研究[J];中華血液學(xué)雜志;1998年06期

本文編號(hào)：2636077