【摘要】：肝臟由胚胎內(nèi)胚層演變而來，胚胎期肝具有重要的造血功能。人胚6周，造血干細胞(hematopoietic stem cell，HSC)從卵黃囊遷入肝，即進入了肝臟造血期。胎兒15～24周，是肝造血的旺盛期。胎肝造血以紅細胞系占絕對優(yōu)勢，也有粒細胞系不同發(fā)育階段的細胞，還有淋巴細胞和巨核細胞。紅細胞系中以中幼紅細胞的數(shù)量最多，粒細胞系數(shù)量少，出現(xiàn)也晚。至胚胎6月肝臟造血逐漸減弱，到出生時由骨髓造血所取代。 胃腸道內(nèi)分泌細胞分泌的血管活性多肽(Vasoactive Intestinal peptide，VIP)具有多種生物學功能，當其隨門靜脈血流進入肝臟后，與肝細胞上的相應受體結(jié)合，內(nèi)在化后被溶酶體降解，很快被清除。因此，肝臟是滅活VIP的主要場所。肝臟局部的VIP及受體對肝臟造血及造血器官的遷移起了何種作用?對造血干細胞在肝臟的橫向分化有何影響也令人感興趣。為回答以上問題，我們探討了VIP對造血干細胞生物學行為的影響及機制。 目的 1．探討VIP對人HSC體外增殖及集落形成的影響，以及可能機制； 2．VIP對人HSC向造血系細胞分化的影響； 3．VIP對人HSC向肝系分化的影響及可能機制，解釋VIP對HSC橫向分化的可能影響； 4．通過胎肝發(fā)育中VIP及VIPR含量的變化，初探胎肝造血轉(zhuǎn)移機制； 5．VIP是否通過HSC上的相應受體介導發(fā)揮上述作用，HSC上VIP受體為何種亞型? 重慶醫(yī)科大學博士學位論文 方法 1.采集人臍血標本，淋巴細胞分離液分離出單個核細胞; 2.免疫磁分選技術(shù)純化人臍血CD34十細胞，流式細胞術(shù)鑒定純度; 3.體外集落形成實驗檢測V正對人HSC集落形成能力的影響; 4.擴增培養(yǎng)計數(shù)VIP對CD34+細胞增殖影響; 5.酶聯(lián)免疫化學法測定培養(yǎng)HSC細胞及上清TNF-a、TGF-B水平，以及A萬P水 平; 6.流式細胞術(shù)檢測CD34+細胞培養(yǎng)過程中各系分化細胞比例; 7.免疫組織化學法檢測 HSC上肝系標志AFP、ALB、CK-19的表達; 8·Westem blot方法檢測Hse上ALB表達; 9.巢式RpPCR方法檢測HSC上AFP、ALB的mRNA表達，隨機選送ALB產(chǎn) 物測序; 10.采集發(fā)育不同期SD大鼠肝臟標本; 11.生物分子相互作用系統(tǒng)(Biacore)測定人HSC、肝臟組織vIPR結(jié)合力; 12.放射免疫法檢測肝臟組織VIP濃度水平; 13.Rl’- PCR方法檢測人HSC、肝臟組織VIPR的mRNA表達。 結(jié)果 1.vIP在10一7m。呱一10一‘2 mof幾濃度范圍內(nèi)可抑制造血干細胞集落形成(抑制率 )26.97士13.72%)，P0.05;在10一8 mol/L抑制作用最大。10·8 moULv護作用 下HSC擴增倍數(shù)第7、10、14天分別依次為1 1 .78士4.39、16.71士2.98、21.69 士3.28倍，顯著低于對照組(20.13士3.32、25.64士3.51、25.33士2.61)，P0.05。 2.vIP作用于HSC后，細胞內(nèi)TNF一a濃度為149.15p創(chuàng)ml，較對照組顯著升高， P0.05，增加T 49%;V正顯著增加T HSC內(nèi)TGF一B，濃度，為116.lop歲ml， 較對照組升高44.41%，P0·05。 重慶醫(yī)科大學博士學位論文 3.1護mo呱的v正作用Hse 14天后，粒系eD13細胞比例為50.33%，對照組 為93.35%，有顯著降低，P0.05;7天組、14天組單核系CD14細胞比例分別 依次為8.20%和15.巧%，對照組分別依次為13.80%和22.55%，也有顯著降低， P0.05。紅系CD71+細胞、巨核系CD41+細胞、B淋巴細胞CD19+細胞、T淋 巴細胞CD4/CDS細胞、祖細胞CD33+細胞在VIP作用前后均無顯著性差異， p0.05。v正作用于CD34細胞7天后，CD34+細胞比例較對照組(18.乃%)明顯 增加(22.0%)，P0.050 4.免疫組化結(jié)果顯示人HSC上不表達CK一19蛋白，但有ArP和ALB蛋白表達; VIP作用HSC 14天后，HSC內(nèi)的AFp濃度(165士8.51 Pg/ml)較對照組(270土 11.37p留ml)顯著下降，P0.05。western blot顯示v正作用后Hse內(nèi)ALB蛋 白表達有減弱趨勢。人臍血單個核細胞和CD34+細胞都表達了AFP mRNA和 A工B mRNA，隨機選取ALB產(chǎn)物測序與Genebank中ALB基因序列完全相同。 5.從胚胎到新生鼠，肝臟vIP量(分別為1349.18士220.37n歲加l，2439.64士394.22 ng/ml)與V正受體表達量(分別為806.67士58.47 RU/ug蛋白，952.5士121.45 RU/ug蛋白)均呈增加趨勢;出生后，從未成年期到成年期肝臟vIP量(分別為 2689·47士227·53ng/ml，1911.79士453.15 ng/ml)與V護受體表達量(分別為 762.5士97.15 RU加g蛋白，425士119.38 RU/ug蛋白)都逐漸降低，即出生前后 呈相反的變化趨勢。值得注意的是，新生期VIP量低于未成年期，但VIP受 體表達量卻正相反。Rl’- PCR顯示大鼠發(fā)育不同時期肝臟都表達VIP受體1型。 6.生物分子相互作用系統(tǒng)顯示人造血干細胞表達 vIPR，結(jié)合量為2366.67 RU枷g 蛋白;Rl’- PCR顯示人臍血造血干細胞和單個核細胞表達V正R一1 mRNA。 結(jié)論 1.VIP可抑制人造血干細胞增殖和集落形成，是一種新被認識的造血抑制劑。 2.V砰抑制人造血干細胞增殖的機制之一是通過上調(diào)HSC內(nèi)造血抑制因子 TNF一a、TGF一B水平實現(xiàn)的。 重慶醫(yī)科大學博士學位論文 3.VIP抑制造血干細胞向粒單系分化，對其向紅系及其它系分化無影響;VIP從 時間上減緩CD34抗原消失，
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10987VIP(一Logmo比)圖3一IV正對HSC集落形成影響Fig.3一1TheeffectofV護onCFUonHSC二、VIP對HSC增殖的影響液體培養(yǎng)體系中，HSC顯示出較強的擴增潛能，但viPl0’sm叮L作用下，，其增殖能力與對照組相比較被顯著抑制。viP10一smol幾作用HSC7天、10天、14天擴增倍數(shù)分別依次為n.78士4.39、16.71士2.98、21.69士3.28，對照組擴增倍數(shù)分別依次為20.13士3.32、25.64士3.81、28.33士2.61，二者相比較有顯著性差異(P<0.05)。圖3一2

HSC及CFU倒置顯微鏡下形態(tài)
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2004
【分類號】：R329.2

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 張占英,鐘宏良,朱固,張瀾生,梁誠,張金龍,諸雪珍;一種富集臍血造血干/祖細胞的簡易方法[J];蘇州醫(yī)學院學報;1998年12期

2 裴雪濤,王立生,徐黎,吳祖澤;臍血 CD_(34)~+ 細胞擴增和改善其移植效率的實驗研究[J];中華血液學雜志;1997年03期

3 裴雪濤,王立生,徐黎,馮凱,李梁,龍紅,吳祖澤;CD_(34)~+造血祖細胞的定向誘導分化研究[J];中華血液學雜志;1998年06期

本文編號：2636077