【摘要】：誘導性多能干細胞(Induced Pluripotent Stem Cell,iPSC)是近年來干細胞研究領(lǐng)域中具有里程碑意義的突破。由體細胞重編程而來的hiPSC為獲得與患者自身遺傳背景一致的多能干細胞增加了一個新途徑,是再生醫(yī)學和組織工程、疾病模型、藥物篩選的理想種子細胞,具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。而hiPSC體外培養(yǎng)條件是否合適則是決定其是否具有應(yīng)用前景的前提,因此也是研究者關(guān)注的熱點。 hiPSC的培養(yǎng)包括了體細胞重編程為hiPSC的過程(稱為hiPSC的誘導培養(yǎng))和hiPSC的擴增培養(yǎng)兩個過程�！昂线m”或者“理想”的hiPSC的培養(yǎng)條件不僅要在擴增培養(yǎng)時維持hiPSC的生物學特性、符合臨床應(yīng)用前景,還包括這種培養(yǎng)條件是否可同時支持體細胞重編程。目前主要使用小鼠胚胎成纖維細胞(Mouse Embryonic Fibroblast,MEF)作為滋養(yǎng)層支持hiPSC的培養(yǎng),但是這種含有鼠源性細胞的培養(yǎng)體系含有許多潛在的微生物感染風險,并且不可避免的帶有異源細胞和蛋白,限制了hiPSC潛在的臨床應(yīng)用價值。因此,仍有待進一步探索“合適”或者“理想”的hiPSC誘導和擴增培養(yǎng)條件。我們關(guān)注于用人源性細胞作為滋養(yǎng)層用于hiPSC的誘導和擴增培養(yǎng)。 第1章人骨髓間充質(zhì)干細胞作為滋養(yǎng)層培養(yǎng)hiPSC方法的建立和研究 人間充質(zhì)干細胞(human Mesenchymal Stem Cell,hMSC)是一種具有多向分化潛能的成體干細胞,可以從少量的骨髓或其他許多組織樣本中分離獲得,可在分成纖維細胞重編程。因此,我們研究了自身成纖維細胞是否可作為滋養(yǎng)層支持hiPSC的誘導和擴增培養(yǎng),并研究以自身成纖維為滋養(yǎng)層誘導培養(yǎng)的hiPSC的生物學特征。 我們從兩個需做包皮環(huán)切術(shù)兒童手術(shù)后廢棄的包皮中分離到兩株包皮成纖維細胞,對二者均進行了相關(guān)研究。將HFF轉(zhuǎn)導攜帶有Klf4、Sox2、Oct4和c-Myc轉(zhuǎn)錄因子的逆轉(zhuǎn)錄病毒后,不再作消化收集,而是在原來的體系中用hiPSC培養(yǎng)液一直培養(yǎng)。我們觀察到,轉(zhuǎn)導病毒后,大部分的成纖維細胞形態(tài)上并沒有發(fā)生改變,且仍具有較強的增殖能力。9-10天后,小部分成纖維細胞聚集成小簇,細胞形態(tài)變短變寬,向上皮樣轉(zhuǎn)變,核仁明顯。約3周后,部分小簇形成較大致密的克隆樣細胞團塊。這些克隆挑選后可繼續(xù)在自身HFF滋養(yǎng)層上擴增,形成典型的hESC形態(tài)。表明在重編程過程中,未發(fā)生有效重編程的自身成纖維細胞可以作為滋養(yǎng)層支持其他成纖維細胞的重編程。 我們主要檢測了擴增后其中一個克隆的特性,免疫熒光檢測結(jié)果顯示這些在自身HFF滋養(yǎng)層上培養(yǎng)的hiPSC表達未分化hESC特有的表面標記,如SSEA-4、 TRA-1-60、TRA-1-81和NANOG;RT-PCR檢測顯示內(nèi)源性KLF4、SOX2、c-Myc. OCT4在這些hiPSC上均被激活,并表達NANOG、DNMT3B、hTERT、DPPA4和NODAL等多個多潛能基因；EB分化實驗和畸胎瘤形成實驗顯示其在體內(nèi)外均可形成典型的三胚層組織,具有向三胚層分化的潛能；此外,培養(yǎng)21代以上后,標準G-帶核型分析實驗顯示這兩個hiPSC克隆的核型均為46,XY,提示hiPSC在自身HFF滋養(yǎng)層上擴增培養(yǎng)后仍維持正常核型。 本研究首次證實了轉(zhuǎn)導了攜帶有Klf4、Sox2、Oct4和c-Myc轉(zhuǎn)錄因子的逆轉(zhuǎn)錄病毒后,未發(fā)生重編程的自身HFF可支持小部分HFF發(fā)生重編程。建立了一種用自身HFF支持hiPSC的誘導和擴增培養(yǎng)的人源化培養(yǎng)體系,為建立符合臨床應(yīng)用需要的hiPSC的培養(yǎng)方法提供了另一種更具有優(yōu)勢的可行途徑,也為研究人成纖維細胞重編程機制提供了一個很好的模型。 第3章不同滋養(yǎng)層對重編程效率和hiPSC自我更新能力、多向分化潛能影響的研究 培養(yǎng)微環(huán)境涉及細胞、細胞外基質(zhì)、細胞因子等各種成分,通過多種途徑影響體細胞重編程和多能干細胞的生物學特征。其中滋養(yǎng)層細胞在培養(yǎng)微環(huán)境中起復雜而重要的作用。我們在研究用hMSC和自身HFF作為滋養(yǎng)層支持成纖維細胞的重編程和培養(yǎng)獲得的hiPSC時,發(fā)現(xiàn)不同的滋養(yǎng)層對體細胞重編程效率和hiPSC自我更新能力、多向分化潛能均具有較明顯的影響。 我們比較了不同滋養(yǎng)層對成纖維細胞重編程效率的影響。通過三次重復實驗,我們發(fā)現(xiàn),HFF在以hMSC、自身HFF為滋養(yǎng)層的培養(yǎng)體系中重編程為hiPSC的效率分別是在以MEF為滋養(yǎng)層的培養(yǎng)體系中重編程效率的7.26%±2.09%(P0.05)、37.08%±5.63%(P0.05)。為了進一步明確導致這種差異的原因,我們用MEF條件培養(yǎng)液培養(yǎng),但是HFF在以hMSC、自身HFF為滋養(yǎng)層的培養(yǎng)體系中重編程為hiPSC的效率并末提高(分別為8.52%±5.4%,35.98%±7.82%),仍然明顯低于其在以MEF為滋養(yǎng)層的培養(yǎng)體系中的重編程效率。 此外,我們檢測了hiPSC克隆在hMSC、 HFF、 MEF這三種類型滋養(yǎng)層上的增殖情況,發(fā)現(xiàn)其平均擴增倍數(shù)分別為2.31±0.12(P0.05)、2.66±0.17(P0.05)、4.77±0.64。同時,我們發(fā)現(xiàn)以MEF為滋養(yǎng)層培養(yǎng)的hiPSC傳代后培養(yǎng)至第5天時,大部分克隆仍維持未分化狀態(tài)(未分化克隆占97.3%±1.15%)；至第7天時,出現(xiàn)小部分分化的克隆(未分化克隆占86.7%±6.81%)。而以hMSC、自身HFF為滋養(yǎng)層培養(yǎng)的hiPSC培養(yǎng)至第5天時,分化的克隆即明顯增多(未分化克隆分別占77.3±10.1%、80.7±5.13%,P0.05)；至第7天時,分化的克隆進一步增多(未分化克隆分別占64.3%±4.93%、67.3%±6.51%,P0.05)。通過流式檢測,我們發(fā)現(xiàn)在hMSC、自身HFF為滋養(yǎng)層培養(yǎng)7天后的hiPSC克隆中TRA-1-60陽性細胞比例(分別為75.6%±3.35%、74.9%±4.72%)均低于以MEF為滋養(yǎng)層培養(yǎng)的hiPSC克隆中TRA-1-60陽性細胞比例。 本研究首次比較了不同滋養(yǎng)層對人成纖維細胞重編程效率的影響,發(fā)現(xiàn)在相同條件下,體細胞在人源性細胞滋養(yǎng)層上發(fā)生重編程的效率明顯低于其在MEF滋養(yǎng)層上的重編程效率。但是,即使使用了MEF條件培養(yǎng)液,成纖維細胞在以hMSC. HFF為滋養(yǎng)層的培養(yǎng)體系中重編程為hiPSC的效率并未提高。同樣,用hMSC、 HFF作為滋養(yǎng)層培養(yǎng)hiPSC時,hiPSC的增殖能力明顯低于其在MEF滋養(yǎng)層上的增殖能力,且更易分化。需要進一步明確導致這些缺陷的原因,以及體細胞重編程、hiPSC自我更新能力和多向分化潛能維持的分子機制,以改進這種hiPSC的人源化培養(yǎng)條件,使其成為一種理想的培養(yǎng)條件。
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R329.2

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4 孫q，

本文編號：2631690