【摘要】：目的：分別通過mTOR和P13K抑制劑干預(yù)以及基因轉(zhuǎn)染技術(shù)建立mTOR及相關(guān)通路抑制和其下游分子過表達(dá)后CVB3感染HeLa細(xì)胞模型,觀察CVB3誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)和凋亡情況及CVB3復(fù)制、凋亡相關(guān)分子的變化,以探討PI3K/Akt/mTOR信號通路在CVB3感染后導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡中的作用。 方法：首先,選用人宮頸癌細(xì)胞株(HeLa)建立經(jīng)典CVB3感染細(xì)胞模型,分別用]mTOR抑制劑—雷帕霉素及P13K抑制劑—LY294002對模型進(jìn)行干預(yù),采用流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率,半定量PCR, Western Blot檢測細(xì)胞凋亡因子Bim、Bax、Caspase-9、Caspase-3及CVB3表達(dá)變化；其次,通過細(xì)胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染技術(shù)分別構(gòu)建4EBP1、p70S6K、Aktl和Akt2過表達(dá)HeLa細(xì)胞系,建立CVB3感染細(xì)胞模型,采用流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率,Real-time PCR和Western Blot檢測細(xì)胞凋亡因子Bim、Bax、Caspase-9、Caspase-3及CVB3表達(dá)變化,免疫熒光及細(xì)胞電鏡技術(shù)檢測病毒復(fù)制情況。最后應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,P0.05為差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果： (1)雷帕霉素、LY294002均可抑制HeLa細(xì)胞活性,并呈濃度依賴效應(yīng)； (2)雷帕霉素、LY294002對CVB3復(fù)制的作用不同但均可促進(jìn)CVB3誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡； (3)雷帕霉素和LY294002可阻斷CVB3對Bim活性的抑制作用,進(jìn)一步促進(jìn)CVB3誘導(dǎo)的Bax活化； (4)雷帕霉素和LY294002促進(jìn)CVB3誘導(dǎo)的Caspase-9活化,同時(shí)促進(jìn)Caspase-3的自我裂解,以啟動(dòng)Caspase級聯(lián)反應(yīng)； (5)空質(zhì)粒過表達(dá)細(xì)胞株建立后,以正常HeLa細(xì)胞作為對照組進(jìn)行Western Bloting驗(yàn)證,pcDNA3.1-myc-HisA(-)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組可見myc標(biāo)簽蛋白的表達(dá)； (6)不同基因過表達(dá)細(xì)胞株建立后,提取細(xì)胞總蛋白,以正常HeLa細(xì)胞及穩(wěn)定表達(dá)空質(zhì)粒HeLa細(xì)胞為對照組進(jìn)行Western Bloting驗(yàn)證,可見質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組分別可見4EBP1、p70S6K、Aktl和轉(zhuǎn)基因Akt2表達(dá)明顯增高； (7)過表達(dá)4EBP1、p70S6K、Aktl或Akt2可促進(jìn)CVB3誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和細(xì)胞病變效應(yīng)； (8)過表達(dá)p70S6K、 Aktl或Akt2可促進(jìn)CVB3mRNA合成而抑制VP1表達(dá),過表達(dá)4EBP1則抑制CVB3mRNA合成而促進(jìn)VP1表達(dá)； (9)CVB3誘導(dǎo)的Bim和Bax的表達(dá)可被過表達(dá)4EBP1、p70S6K抑制,同時(shí)可被過表達(dá)Akt進(jìn)一步活化； (10)CVB3誘導(dǎo)的Procaspase-9、Caspase-3自我裂解可被過表達(dá)4EBP1、p70S6K激活,同時(shí)被被過表達(dá)Aktl、Akt2阻斷。 結(jié)論： (1)mTORC1和P13K被分別抑制后在CVB3誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過程中其調(diào)節(jié)機(jī)制可能不同：P13K抑制劑LY294002通過上調(diào)CVB3mRNA和Bim、Bax、Caspase-9和Caspase-3的活性來促進(jìn)CVB3誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。而與此不同的是,mTOR抑制劑雷帕霉素在調(diào)節(jié)凋亡分子表達(dá)的同時(shí)通過上調(diào)CVB3衣殼蛋白VP1而非mRNA的表達(dá)來促進(jìn)細(xì)胞凋亡。 (2)成功構(gòu)建真核表達(dá)載體pcDNA3.1-myc-HisA(-)及pcDNA3.1-myc-HisA(-)-4EBP1/p70S6K/Akt1/Akt2. (3)應(yīng)用脂質(zhì)體成功對各真核表達(dá)載體進(jìn)行了細(xì)胞轉(zhuǎn)染,并成功構(gòu)建穩(wěn)定過表達(dá)pcDNA3.1-myc-HisA(-)及pcDNA3.1-myc-HisA(-)-4EBP1/p70S6K/Akt1/Akt2的HeLa細(xì)胞株。 (4)過表達(dá)4EBP1、p70S6K、Aktl或Akt2通過不同的機(jī)制促進(jìn)CVB3誘導(dǎo)的HeLa細(xì)胞凋亡：過表達(dá)4EBP1、p70S6K通過一條不依賴Bim和Bax的凋亡途徑促進(jìn)細(xì)胞細(xì)胞凋亡,同時(shí)過表達(dá)4EBP1還可促進(jìn)病毒的復(fù)制；相反,過表達(dá)Akt1、Akt2促進(jìn)細(xì)胞凋亡則是通過一條不依賴Caspase家族的凋亡途徑。
【圖文】：

差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；各濃度組間比較，lOCHiM組P<0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表1-8、 1-9,圖1-1)。表1 -8不同濃度雷帕霉素對HeLa細(xì)胞增殖活性的影響（MTT法）Rapamycin (nM)分組 Sham DMSO, 10 25 50 100MTT 值68.00±4.02b68.58±5.44" 62.48±5.37'' 61.94±4.0廣 58.62±4.17''' 49.68±5.03^注：a,與DMSO組比較，^"<0.05; b,與lOOnM組比較，尸<0.05。表1-9不同濃度LY294002對HeLa細(xì)胞增殖活性的影響（MTT法）LY294002 (^M)分組 Sham DMSO' 5 10 25 50 100MTTfl 68.00±4.02^ 68.58±5.44'' 50.40±5.44'' 43.44±6.39'^ 41.92±4.60^'' 41.46±5.12''' 33.30±5.35'注：a,與DMSO組比較，P<0.05: b,與 100|Jvl組比較，b6<0.05。0.8 . b b bI I II 11Z Z Z Z / ZRapamycini IliliilA^ ^ ^ ^ ^LY294002圖1-1不同濃度雷帕霉素、LY294002對HeLa細(xì)胞增殖活性的影響17

論文 第1章雷帕霉素和LY294002對CVB3誘導(dǎo)的HeLa細(xì)胞調(diào)不同濃度雷帕霉素對HeLa細(xì)胞活性的影響，B為不同濃度LY294002對HeLa。a,與DMSO組比較，，_P<0.05; b,與100^11^1組比較，尸<0.05。CVB3在HeLa細(xì)胞上擴(kuò)增并進(jìn)行病毒滴度測定B3感染HeLa細(xì)胞后，約12 h出現(xiàn)明顯CPE，2?3天后CPE可達(dá)100生CPE時(shí)，細(xì)胞失去原有正常形態(tài)，變圓、變暗，漂浮呈葡萄串樣E,至第7天CPE不再進(jìn)展時(shí)^u始統(tǒng)計(jì)。實(shí)驗(yàn)中CPE陽性率高于50%的百分?jǐn)?shù)為50，低于50%的百分?jǐn)?shù)為0。nench公式，距離比例=(CPE陽性率高于50%的百分?jǐn)?shù)-50) / (C50%的百分?jǐn)?shù)-CPE陽性率低于50%的百分?jǐn)?shù)）= (50-50)/(50-0)=0, =大于50%的陽性百分比的最高稀釋度對數(shù)+距離比例X稀釋度間距得到的值查反對數(shù)表。即lgTCID50=9+0=9，TCID50=10_9(圖1-2，
【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R329.2

【參考文獻(xiàn)】

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1 陳淳媛;孫躍女;楊作成;蔡姿麗;楊敏;;雷帕霉素對柯薩奇病毒B3誘導(dǎo)的大鼠心肌細(xì)胞mTOR和eIF-4E表達(dá)的調(diào)控作用[J];中南大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2008年07期

2 周虹;黃向陽;楊婷;汪濤;徐丹;文富強(qiáng);;LY294002對人纖維肉瘤HT1080細(xì)胞生長的影響及機(jī)制研究[J];四川大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2010年01期

3 陳淳媛;楊敏;蔡姿麗;孫躍女;楊作成;;雷帕霉素對柯薩奇病毒B3誘導(dǎo)的大鼠心肌細(xì)胞Ⅰ型膠原表達(dá)的調(diào)控[J];中國新藥雜志;2009年13期

4 單廣夷;孔垂?jié)?李軍;張哲;陳啟光;;雷帕霉素對膀胱癌T24細(xì)胞增殖及侵襲能力的影響[J];中國醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2011年04期

本文編號：2623135