【摘要】：布魯氏菌是典型的人畜共患胞內(nèi)寄生菌，牛、羊、豬等家畜感染后能引起流產(chǎn)和不孕，人感染布病引起關(guān)節(jié)炎、地中海熱等。布魯氏菌病在世界各地廣泛流行，危害嚴(yán)重。布魯氏菌通過呼吸道、消化道和皮膚黏膜等感染宿主，進入宿主后被宿主巨噬細(xì)胞吞噬，與巨噬細(xì)胞膜相互作用形成BCV吞噬小體，約有10%的布魯氏菌存活下來。布魯氏菌在BCV吞噬小體內(nèi)面臨營養(yǎng)脅迫、低pH、低氧等苛刻環(huán)境壓力，但吞噬小體內(nèi)同時也為布魯氏菌提供了一個逃避細(xì)胞吞噬、清除的內(nèi)環(huán)境。因此，胞內(nèi)生存是布魯氏菌致病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。本研究通過對體外模擬巨噬細(xì)胞內(nèi)營養(yǎng)脅迫條件與正常實驗室培養(yǎng)條件下的布魯氏菌轉(zhuǎn)錄組進行測序，，比較分析營養(yǎng)脅迫條件下布魯氏菌基因表達的變化，揭示與營養(yǎng)脅迫條件相關(guān)的毒力、致病、代謝等分子機制，進而為布魯氏菌的胞內(nèi)生存機制研究奠定基礎(chǔ)。細(xì)菌非編碼小RNA（non-coding small RNA，sRNA）是近年來在細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)的一類RNA調(diào)控子，在應(yīng)對環(huán)境變化的基因表達調(diào)控中發(fā)揮重要作用，是細(xì)菌適應(yīng)環(huán)境壓力的重要調(diào)控子。本研究通過轉(zhuǎn)錄組測序分析營養(yǎng)脅迫條件下的布魯氏菌sRNA，同時結(jié)合生物信息學(xué)預(yù)測sRNA，對得到的sRNA進行功能分析，尋找與布魯氏菌適應(yīng)胞內(nèi)壓力環(huán)境相關(guān)的sRNA，揭示sRNA在布魯氏菌胞內(nèi)生存中的調(diào)控作用。 分別在營養(yǎng)脅迫培養(yǎng)基GEM7.0與標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基TSB7.0中培養(yǎng)布魯氏菌標(biāo)準(zhǔn)強毒株16M，提取總RNA進行轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-seq）。對測序結(jié)果進行分析，結(jié)果顯示，與正常實驗室培養(yǎng)條件（TSB7.0）相比，布魯氏菌16M在營養(yǎng)脅迫條件下，大量基因表達發(fā)生明顯的改變。3199個基因中，差異表達的基因有689個（21.54%），其中上調(diào)表達的基因有308個（9.63%），下調(diào)381個（11.91%）。在營養(yǎng)脅迫條件下，參與脂肪酸第一階段代謝關(guān)鍵酶富集性上調(diào)表達，參與脂肪酸第二階段代謝相關(guān)酶都富集性下調(diào)表達，表明營養(yǎng)脅迫條件下布魯氏菌的脂肪酸代謝過程受到了影響。營養(yǎng)脅迫條件下，致病機制與細(xì)菌分泌系統(tǒng)相關(guān)基因廣泛上調(diào)，表明營養(yǎng)脅迫與細(xì)菌致病性是布魯氏菌緊密協(xié)作（coordinated）的兩個特性。營養(yǎng)脅迫條件下，T4SS系統(tǒng)相關(guān)基因富集性高表達，進一步證實T4SS對于布魯氏菌抵抗外界不良環(huán)境具有重要作用；OmpR以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)反應(yīng)調(diào)控基因上調(diào)，暗示該通路是布魯氏菌適應(yīng)營養(yǎng)脅迫的重要組成；O抗原輸出系統(tǒng)基因表達水平下調(diào)，暗示布魯氏菌在營養(yǎng)脅迫情況下可能導(dǎo)致光滑型LPS的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化成粗糙型。 對RNA-Seq方法獲得的原始測序結(jié)果進行拼裝和生物信息學(xué)分析尋找布魯氏菌的sRNA。首先篩選位于基因間區(qū)，與鄰近基因距離大于20nt，表達量與鄰近基因相差15%的peak為候選peak。選取候選peak中高豐度表達的peak，向上游延伸200nt預(yù)測轉(zhuǎn)錄啟動子，向下游延伸200nt預(yù)測轉(zhuǎn)錄終止子。從其中篩選出具有啟動子和終止子的區(qū)域為sRNA的表達轉(zhuǎn)錄區(qū)域。通過篩選分析，最終得到48個sRNA，其中23個位于正鏈上，25個位于負(fù)鏈上。同時，我們通過轉(zhuǎn)錄單元預(yù)測法還預(yù)測出21個sRNA分子，其中15個位于正義鏈上，6個位于反義鏈上。利用northern blot對轉(zhuǎn)錄單元預(yù)測法預(yù)測出的21個sRNA進行驗證，結(jié)果表明共有15個sRNA存在轉(zhuǎn)錄本。由于sRNA多位于基因間區(qū)，有可能與鄰近的基因存在共轉(zhuǎn)錄，我們對這15個Northern blot驗證陽性的sRNA與鄰近基因的共轉(zhuǎn)錄情況進行了分析。結(jié)果表明，其中6個sRNA與鄰近的上下游基因不在一條鏈上，肯定是單獨轉(zhuǎn)錄的；而剩余的9個sRNA則通過RT-PCR的方法進行了驗證，結(jié)果表明僅BSR5與BSR8與鄰近基因不存在共轉(zhuǎn)錄，是單獨轉(zhuǎn)錄的。 對單獨轉(zhuǎn)錄的BSR16和BSR17進行了進一步的研究，首先通過5’RACE與3’RACE尋找BSR16與BSR17的轉(zhuǎn)錄起點與轉(zhuǎn)錄終點。實驗結(jié)果表明，BSR16的轉(zhuǎn)錄起點為635852，轉(zhuǎn)錄終點為636137；BSR17的轉(zhuǎn)錄起點為1187596，轉(zhuǎn)錄終點為1187668。為了分析BSR16和BSR17的功能，我們構(gòu)建了BSR16和BSR17的缺失株和過表達株，并對野生株、缺失株和過表達株的相關(guān)表型進行了比較分析，主要包括：生長曲線、體外刺激條件下的生存能力、饑餓實驗和小鼠體內(nèi)生存能力等。從生長曲線可以看出，當(dāng)BSR16或BSR17缺失和過表達時，布魯氏菌的生長速度減慢，提示BSR16、BSR17與布魯氏菌的生長代謝相關(guān)。巨噬細(xì)胞內(nèi)生存和繁殖是布魯氏菌致病的關(guān)鍵，巨噬細(xì)胞內(nèi)環(huán)境中包含多種殺（抑）菌物質(zhì)，而布魯氏菌必須適應(yīng)這種環(huán)境才能在胞內(nèi)生存和繁殖。因此，我們又分析BSR16和BSR17的缺失株和過表達株在模擬巨噬細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的多種體外脅迫條件下的生存能力，包括：高鹽、高滲透壓、氧化應(yīng)激、酸、熱等。實驗結(jié)果表明，與16M野生株相比，BSR16過表達株16M-BSR16在各種體外脅迫條件下的生存率明顯降低，而BSR16缺失突變株僅在高熱壓力下生存率下降。結(jié)果提示，BSR16的過表達可能導(dǎo)致布魯氏菌抵抗外界環(huán)境壓力的能力減弱。對于BSR17，在高鹽、高熱和氧壓力條件，BSR17的缺失株和過表達株的生存率均明顯降低。而在高滲條件下，僅BSR17突變株的生存率下降；在低pH值條件，僅過表達株的生存率下降。營養(yǎng)脅迫條件是布魯氏菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)生存時遇到的重要環(huán)境壓力，因此，我們又分析了BSR16和BSR17的缺失株和過表達株在營養(yǎng)脅迫條件下的長期生存能力。實驗結(jié)果表明，BSR16和BSR17過表達時，布魯氏菌在營養(yǎng)脅迫條件下的生存能力均明顯減弱。為了進一步明確BSR16和BSR17與布魯氏菌胞內(nèi)存活能力的關(guān)系，我們對BSR16和BSR17的缺失株和過表達株在小鼠體內(nèi)的生存能力進行了比較分析。實驗結(jié)果表明，BSR16和BSR17的缺失與過表達均影響了布魯氏菌在小鼠脾臟細(xì)胞內(nèi)的生存能力，提示BSR16和BSR17的正確表達對于布魯氏菌在小鼠體內(nèi)的長期生存是必須的。 細(xì)菌的sRNA主要通過靶標(biāo)mRNAs來發(fā)揮轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用，因此，尋找受sRNA調(diào)控的靶基因是研究sRNA作用機制的關(guān)鍵。我們首先通過生物信息學(xué)對BSR16和BSR17的靶基因進行了預(yù)測分析。結(jié)果表明，BSR16的靶基因主要涉及物質(zhì)的轉(zhuǎn)運和代謝、轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后修飾、胞內(nèi)運輸、細(xì)胞膜合成、能量產(chǎn)生與轉(zhuǎn)化等；BSR17的靶基因主要涉及物質(zhì)轉(zhuǎn)運和代謝基因、復(fù)制、基因重組和修復(fù)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制等。其中，多個靶基因與布魯氏菌的胞內(nèi)生存能力有關(guān)。由于大多細(xì)菌sRNA與靶標(biāo)mRNA的結(jié)合依賴于RNA分子伴侶Hfq，因此，我們分析了BSR16與Hfq的相關(guān)性。實驗結(jié)果表明，BSR16與Hfq密切相關(guān)，是Hfq依賴性sRNA，當(dāng)Hfq缺失后，BSR16的表達明顯降低。為進一步分析BSR16的功能，我們利用雙向電泳-質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法比較了16M和BSR16過表達株的全菌蛋白表達的差異，從蛋白質(zhì)組水平鑒定BSR16調(diào)控的靶基因。研究結(jié)果表明，當(dāng)BSR16過表達后，布魯氏菌的蛋白表達發(fā)生了明顯的變化。這些差異表達的蛋白主要涉及：物質(zhì)轉(zhuǎn)運和代謝、能源產(chǎn)生和轉(zhuǎn)換、轉(zhuǎn)錄、翻譯、翻譯后修飾、細(xì)胞膜合成、分子伴侶和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制等。其中很多與布魯氏菌的胞內(nèi)生存和環(huán)境壓力適應(yīng)相關(guān)。BSR16過表達后，這些靶基因的表達發(fā)生改變，最終影響了布魯氏菌對環(huán)境壓力的適應(yīng)能力和胞內(nèi)生存能力。以上研究結(jié)果表明布魯氏菌內(nèi)存在一定數(shù)量的sRNA，而且sRNA在布魯氏菌抵抗與適應(yīng)巨噬細(xì)胞內(nèi)惡劣環(huán)境中發(fā)揮重要作用。 本研究通過對布魯氏菌在營養(yǎng)脅迫條件下的轉(zhuǎn)錄組測序、差異基因表達分析，對布魯氏菌在營養(yǎng)脅迫條件下的毒力、致病、代謝等分子機制有了一定的認(rèn)識。結(jié)合轉(zhuǎn)錄組測序和生物信息學(xué)預(yù)測對布魯氏菌的全基因組進行掃描分析，尋找布魯氏菌的sRNA，并對sRNA在布魯氏菌適應(yīng)環(huán)境壓力和胞內(nèi)生存中發(fā)揮的作用及其調(diào)控的靶基因進行了詳細(xì)的探討，為研究布魯氏菌抵抗環(huán)境壓力及胞內(nèi)生存機制提供了重要線索。
【圖文】：

ig.3-14: the survival persent of 16M,16M- BSR16 and 16M-BSR16 under stress conditio由圖 3-15 可以看出，在高鹽、高滲透壓、氧化應(yīng)激、低 pH 值與熱應(yīng)激條件6M-△BSR17 突變株和 16M-BSR17 過表達株的生存率遠(yuǎn)低于野生株 16M。在氧化應(yīng)激 pH 條件下 16M-△BSR17 突變株和 16M-BSR17 過表達株的生存率與野生株 16M 的差化顯著，氧化應(yīng)激條件下 16M-△BSR17 突變株和 16M-BSR17 過表達株的生存率幾乎。16M-△BSR17 突變株和 16M-BSR17 過表達株的生存率明顯降低的結(jié)果表明，BSR缺失與過表達時，在模擬巨噬細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的刺激條件下的生存率降低、抵抗各種壓力的下降，特別是在氧化應(yīng)激與低 pH 值條件下，影響了布魯氏菌適應(yīng)胞內(nèi)氧化應(yīng)激與酸堿的能力。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R378.51;R3416

【參考文獻】

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本文編號：2618794