【摘要】： 人高致病性禽流感H5N1病毒(以下簡(jiǎn)稱(chēng)“H5N1”病毒)對(duì)人類(lèi)健康的巨大威脅不僅在于造成當(dāng)前嚴(yán)重的個(gè)體感染甚至死亡,更因?yàn)镠5N1病毒有可能經(jīng)過(guò)不斷變異獲得人際傳播能力,導(dǎo)致新一輪人間流感大流行。因此,需要發(fā)展有效的疫苗應(yīng)對(duì)H5N1病毒的潛在威脅。然而,目前H5N1病毒已通過(guò)快速變異形成多個(gè)進(jìn)化分支(clade)�？紤]到H5N1病毒變異及疫苗生產(chǎn)條件對(duì)疫苗時(shí)效性的影響,基于保守的抗原組分發(fā)展對(duì)不同進(jìn)化分支H5N1病毒具有交叉免疫保護(hù)效果的通用型疫苗進(jìn)行提前接種,可以在應(yīng)對(duì)潛在的H5N1病毒大流行中發(fā)揮重要作用。本研究基于H5N1病毒高保守的M2e,以合成具有四分支鏈并聯(lián)結(jié)構(gòu)的M2e多抗原肽(M2e四分肽)和重組表達(dá)具有M2e與新型佐劑蛋白ASP-1串聯(lián)結(jié)構(gòu)的融合蛋白為策略,系統(tǒng)開(kāi)展了H5N1病毒通用型疫苗基礎(chǔ)研究,籍此擴(kuò)展有效的H5N1病毒預(yù)防手段,加強(qiáng)防控H5N1病毒潛在大流行的能力。 1. H5N1病毒M2e保守性和血清交叉反應(yīng)性分析 為了分析H5N1病毒M2e保守性,確定發(fā)展H5N1病毒通用型疫苗的靶抗原,本研究從NCBI流感資源中心調(diào)取不同時(shí)間、不同宿主來(lái)源的H5N1病毒M2蛋白全長(zhǎng)序列進(jìn)行比對(duì),系統(tǒng)分析了M2e的保守性,獲得了不同來(lái)源H5N1病毒株M2e的共有序列。與人流感病毒M2e共有序列比較的結(jié)果表明,兩者有多個(gè)氨基酸殘基存在差異;進(jìn)一步的血清交叉反應(yīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,禽流感病人血清中可以檢測(cè)到H5N1病毒M2e特異性抗體;但流感病人血清幾乎不與H5N1病毒M2e抗原反應(yīng);而人流感病毒M2e特異性的小鼠免疫血清與H5N1病毒M2e抗原交叉反應(yīng)的抗體滴度不足102。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,本研究在H5N1病毒通用型疫苗設(shè)計(jì)中以M2e為靶抗原,而其序列參照H5N1病毒M2e共有序列。 2.以M2e四分肽為基礎(chǔ)的人高致病性禽流感H5N1病毒通用型疫苗研究 (1)為了有效評(píng)價(jià)基于M2e發(fā)展的交叉保護(hù)性疫苗在抵御不同進(jìn)化分支H5N1病毒感染時(shí)的能力,本研究以BALB/c小鼠為對(duì)象,選擇clade1病毒株(A/Vietnam/1194/04)和clade2.3.4病毒株(A/Shenzhen/406H/06),建立了用于M2e疫苗攻毒保護(hù)效果評(píng)價(jià)的小鼠模型。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,10LD50攻毒劑量下小鼠體重急劇下降,并在10天內(nèi)全部死亡;肺組織病毒滴度在攻毒后第5天出現(xiàn)高峰,并出現(xiàn)了與臨床上相似的肺組織病理?yè)p傷。實(shí)驗(yàn)最終確定以肺組織病毒滴度、肺組織病理?yè)p傷、體重變化和存活率作為最重要的評(píng)價(jià)指標(biāo)來(lái)評(píng)價(jià)M2e誘導(dǎo)免疫保護(hù)的效果。 (2)為了增強(qiáng)M2e的免疫原性,并在一定程度上模擬天然M2e的四聚體形式,本研究設(shè)計(jì)并合成了具有四分支鏈結(jié)構(gòu)的M2e多抗原肽(M2e四分肽);用合成的M2e四分肽免疫小鼠,進(jìn)行了免疫原性分析,并通過(guò)致死劑量(10LD50)下的攻毒試驗(yàn)評(píng)價(jià)了其在不同進(jìn)化分支H5N1病毒攻擊時(shí)的交叉免疫保護(hù)效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,M2e四分肽免疫原性顯著增強(qiáng);M2e四分肽免疫的小鼠在clade1(A/Vietnam/1194/04)和clade2.3.4(A/Shenzhen/406H/06)H5N1病毒攻擊后的肺部病毒復(fù)制顯著降低、組織病理?yè)p傷明顯減輕、存活率達(dá)到70%以上,表現(xiàn)出對(duì)不同進(jìn)化分支H5N1病毒有效的交叉免疫保護(hù)效果。 3.以M2e-ASP-1融合蛋白為基礎(chǔ)的人高致病性禽流感H5N1病毒通用型疫苗研究 本研究采用將M2e與新型佐劑蛋白ASP-1融合的策略進(jìn)行H5N1病毒通用型疫苗研究。 (1)本研究同時(shí)采用增加M2e拷貝和將M2e與佐劑活性成分相連的策略,在原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)單個(gè)M2e分子與ASP-1融合(M2e-ASP-1)或3個(gè)M2e分子與ASP-1融合(M2e3-ASP-1)的重組蛋白;同時(shí)表達(dá)了pET32a(+)載體無(wú)佐劑活性的伴侶分子trxA與3個(gè)M2e分子融合的重組蛋白(TrxA-M2e3)作為對(duì)照。用重組表達(dá)的融合蛋白進(jìn)行了動(dòng)物免疫和攻毒保護(hù)試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,M2e-ASP-1和M2e3-ASP-1重組蛋白免疫時(shí)無(wú)需使用佐劑即可誘導(dǎo)出高滴度的M2e特異性抗體,并且可以有效誘導(dǎo)細(xì)胞免疫反應(yīng);而具有M2e多聯(lián)體結(jié)構(gòu)的M2e3-ASP-1比含有M2e單體的M2e-ASP-1免疫效果更好。使用clade1(A/Vietnam/1194/04)和clade2.3.4(A/Shenzhen/406H/06)H5N1病毒在高致死劑量病毒(10LD50)攻擊后,M2e3-ASP-1重組蛋白免疫小鼠肺組織的病毒復(fù)制顯著降低,病理?yè)p傷明顯減輕,存活率高達(dá)70%～80%;而在3LD50致死劑量攻擊下,M2e3-ASP-1重組蛋白可使免疫的小鼠全部存活,對(duì)不同進(jìn)化分支H5N1病毒的攻擊起到了完全的保護(hù)作用。 (2)為了深入了解當(dāng)H5N1病毒變異導(dǎo)致HA不能產(chǎn)生保護(hù)性免疫時(shí)M2e誘導(dǎo)交叉免疫保護(hù)的能力,本研究利用昆蟲(chóng)桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)重組表達(dá)了H5N1病毒A/Vietnam/1194/04株的HA抗原,并與M2e3-ASP-1重組蛋白聯(lián)合免疫;參照HA抗原常規(guī)免疫程序,采用免疫兩次,間隔4周的方案免疫小鼠,并使用clade1(A/Vietnam/1194/04)和clade2.3.4(A/Shenzhen/406H/06)H5N1病毒在高致死劑量病毒(10LD50)下進(jìn)行攻毒保護(hù)試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,HA與M2e3-ASP-1聯(lián)合免疫能夠同時(shí)誘導(dǎo)出高滴度的HA特異性抗體和M2e特異性抗體;免疫小鼠具有針對(duì)A/Vietnam/1194/04株H5N1病毒的高滴度中和抗體,并能在該株病毒攻擊后全部存活;而在采用另一進(jìn)化分支H5N1病毒株(A/Shenzhen/406H/06)進(jìn)行的中和試驗(yàn)和攻毒保護(hù)試驗(yàn)中,該病毒株HA抗原變異導(dǎo)致聯(lián)合免疫后的血清抗體不具中和活性;但M2e3-ASP-1的參與使聯(lián)合免疫小鼠在致死劑量攻擊后的存活率達(dá)到60%。相比之下,沒(méi)有M2e3-ASP-1參與,HA免疫小鼠在同樣劑量(10LD50)A/Shenzhen/406H/06株H5N1病毒攻擊后全部死亡。本研究表明,M2e3-ASP-1重組蛋白在HA抗原因病毒變異失去免疫保護(hù)作用的情況下仍能提供有效的交叉免疫保護(hù)。 4. H5N1病毒M2e四分肽對(duì)甲型H1N1流感病毒交叉免疫保護(hù)實(shí)驗(yàn)研究 目前擔(dān)心H5N1病毒變異后人間大流行的一個(gè)重要方面就是它與2009年造成全球流感大流行的甲型H1N1流感病毒重組。本研究通過(guò)分析發(fā)現(xiàn),甲型H1N1流感病毒與H5N1病毒的M2e共同序列只有一個(gè)氨基酸殘基不同。為了探討H5N1病毒M2e對(duì)甲型H1N1流感病毒的交叉免疫保護(hù)作用,本研究采用H5N1病毒M2e四分肽免疫小鼠,并使用致死劑量的甲型H1N1流感病毒進(jìn)行攻毒保護(hù)試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,H5N1病毒M2e四分肽免疫可以誘導(dǎo)產(chǎn)生與甲型H1N1流感病毒M2e交叉反應(yīng)的高滴度抗體;并在受到致死性攻擊后產(chǎn)生完全的免疫保護(hù),存活率達(dá)到100%。 綜上所述,本研究明確了H5N1病毒保守的M2e在發(fā)展H5N1病毒通用型疫苗中的重要價(jià)值;證實(shí)了本研究在發(fā)展該類(lèi)疫苗時(shí)采取的設(shè)計(jì)策略對(duì)提高疫苗免疫原性和免疫保護(hù)效果的有效性;揭示了這些免疫原性增強(qiáng)策略對(duì)于獲得和提高免疫保護(hù)效果的必要性;預(yù)示出在此基礎(chǔ)上發(fā)展的H5N1病毒通用型疫苗對(duì)防控H5N1病毒引起的人間流感大流行具有重要意義。
【圖文】：

第一部分 H5N1 病毒 M2e 保守性和血清交叉反應(yīng)性分析Since 1996 Since 2003A B 結(jié)果.1 H5N1 病毒 M2e 多序列比對(duì)與保守性分析本研究從 NCBI 流感資源中心調(diào)取 H5N1 病毒 M2 全長(zhǎng)氨基酸序列，獲得了全部主范圍的序列 1100 條、宿主為禽類(lèi)的序列 922 條、宿主為人類(lèi)的序列 142 條；同還將時(shí)間限制在人感染 H5N1 病毒病例再次出現(xiàn)的 2003 年之后，獲得了全部宿主圍的序列 997 條、宿主為禽類(lèi)的序列 844 條、宿主為人類(lèi)的序列 123 條。利用 Jalview件分別對(duì)這些組序列進(jìn)行了多序列比對(duì)，獲得了一致的 M2e 共有序列，，均為：MSLLTEVETPTRNEWECRCSDSSD”。從軟件的分析結(jié)果可以發(fā)現(xiàn) M2e 在 H5N1毒各個(gè)分離株之間，特別是在 2003 年以后的病毒株之間非常保守（圖 1.1）。

第一部分 H5N1 病毒 M2e 保守性和血清交叉反應(yīng)性分析A B本研究調(diào)取了排除造成2009年全球流感大流行的甲型H1N1病毒之后3845條人流感病毒 M2 全長(zhǎng)序列和 3143 條禽流感病毒 M2 全長(zhǎng)序列，分別進(jìn)行比對(duì)分析，獲得的共有序列與文獻(xiàn)報(bào)道一致[36]。而它們與 H5N1 病毒 M2e 共有序列存在差異，特別是人流感病毒 M2e 共有序列在多個(gè)位點(diǎn)的氨基酸與 H5N1 病毒的不同（圖 1.2）。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類(lèi)號(hào)】：R392

【引證文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2612994