【摘要】：骨質疏松癥(osteoporosis, OP)是一種以骨小梁減少、骨脆性增加為病理特征的代謝性骨病。在我國,約有2.1億人骨量低于正常標準,至少有近7000萬人患有骨質疏松癥。其中絕經后骨質疏松癥的發(fā)病率占據了骨質疏松總發(fā)病率的70%以上,由絕經后骨質疏松引發(fā)的骨脆性骨折,致殘率和致死率均較高,嚴重威脅著中老年婦女的骨骼健康。因此,研制一種能夠有效治療絕經后骨質疏松的疫苗,能夠顯著提高中老年婦女生活質量、降低社會和家庭負擔。 長期以來,雌激素(estrogen)缺乏被認為是誘發(fā)絕經后骨質疏松的關鍵病因。激素替代療法(hormone replacement therapy, HRT),尤其是雌激素替代療法(estrogen replacement therapy, ERT)在臨床上的廣泛應用,也確實取得了一定的效果。有研究表明,雌激素能夠通過下調IL-1、IL-6和TNF-α等炎癥因子抑制破骨細胞分化,進而抑制骨吸收。但是,單純的雌激素水平降低并不能充分解釋性腺機能衰退導致的骨丟失。使用基因敲除鼠的研究發(fā)現,將雌激素受體a和β同時敲除的小鼠去勢(ovariectomy, OVX),小鼠僅發(fā)生了輕微的骨質疏松,而單純敲除雌激素α或β受體,小鼠則具有正常的骨量。這說明雌激素缺乏并非絕經后骨質疏松的單一誘因。 研究發(fā)現,若在去勢的同時摘除垂體(hypophysectomy),小鼠的骨量高于單純去勢的小鼠,這表明垂體分泌的激素在絕經后骨質疏松發(fā)生過程中發(fā)揮著非常關鍵的作用。垂體主要分泌卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone, FSH)和黃體生成素(luteinizing hormone, LH)。在圍絕經期早期,FSH水平就已經開始升高,并且FSH水平的升高與骨量的丟失相一致。但是,之前僅將FSH水平的升高作為絕經開始的標志之一,而未將其認為是骨質疏松的誘發(fā)因素。然而隨著研究的深入,發(fā)現圍絕經期存在FSH血漿水平異常升高、FSH血漿濃度與骨丟失密切相關等現象。并且最近的研究發(fā)現,FSH通過促進破骨細胞的形成,在骨質疏松發(fā)生中發(fā)揮著至關重要的作用。Mone ZaiDi等人發(fā)現破骨細胞的表面存在卵泡刺激素受體(follicle-stimulating hormone receptor, FSHR), FSH能夠直接作用于破骨細胞表面的FSHR,激活MEK/Erk、NF-κB、Akt信號通路,促進破骨細胞的形成,進而促進骨吸收,調節(jié)骨量。這些研究結果均提示,FSH是誘發(fā)絕經后骨質疏松的關鍵病因。 因此,我們認為阻斷FSH與FSHR的結合,能夠有效地治療絕經后骨質疏松。 方法 基于Mone ZaiDi等人的研究結果,我們設計了針對FSH的絕經后骨質疏松蛋白疫苗,并進行了體外實驗和體內實驗： (1)檢測外源性FSH對于破骨細胞分化和成骨細胞分化的影響。在破骨細胞誘導分化過程中和成骨細胞誘導分化過程中外源性加入FSH,檢測其在不同濃度條件下對破骨細胞分化和成骨細胞分化的影響。 (2)制備GST-hFSHβ重組蛋白。利用大腸桿菌對于密碼子的偏愛性,優(yōu)化人FSHp亞基(human FSH β subunit, hFSHβ)的成熟肽編碼序列。通過化學合成的方法獲得優(yōu)化后的hFSHβ基因,并通過BamH I-EcoR I酶切位點克隆至pGEX-4T-1原核表達載體。IPTG誘導表達后,利用GSTrap親和層析柱純化GST-hFSHβ重組蛋白,并通過透析、冷凍干燥等方法,進行蛋白的除鹽、濃縮和定量。 (3)以GST-hFSHβ重組蛋白為抗原免疫OVX大鼠,以期治療OVX大鼠的骨質疏松。將GST-hFSHβ重組蛋白與弗氏佐劑等體積混合后,皮下注射(subcutaneously, s.c.)免疫OVX大鼠,并通過Micro CT分析、三點彎曲實驗、壓力實驗、組織形態(tài)學檢測和血尿生化分析.ELISA檢測等方法,評價以GST-hFSHβ重組蛋白為抗原免疫OVX大鼠對于OVX大鼠骨質疏松的治療情況。 結果 通過體外和體內實驗,我們獲得了如下實驗結果： (1)外源性FSH能夠以劑量依賴方式促進破骨細胞分化,且該作用能夠被抗hFSHβ抗血清阻斷。在骨髓單核細胞向破骨細胞誘導分化過程中,外源性加入3ng/mL、10ng/mL和30ng/mL的FSH,發(fā)現外源性FSH對于細胞生長狀態(tài)無明顯影響的同時,破骨細胞分化的數量以及破骨細胞細胞核形成的數量對于FSH濃度均呈劑量依賴性升高,且在較低濃度(3ng/mL)時即可有明顯的促進作用。在破骨細胞誘導分化過程中,加入抗hFSHβ抗血清,發(fā)現高濃度FSH (30ng/mL)對于破骨細胞分化的促進作用被阻斷。 (2)成功在大腸桿菌內表達GST-hFSHβ重組蛋白。通過刪除hFSHβ信號肽序列、利用大腸桿菌偏愛密碼子對hFSHβ成熟肽核酸序列進行優(yōu)化以及對蛋白誘導表達條件(IPTG濃度、誘導時間、誘導溫度、轉速)進行優(yōu)化等方法,提高蛋白表達量。以優(yōu)化后的條件表達GST-hFSHβ重組蛋白,蛋白表達量可達到菌體總蛋白的31.4%。通過GSTrap親和層析柱純化、透析、冷凍干燥,獲得了干燥的GST-hFSHβ重組蛋白。 (3)以GST-hFSHβ重組蛋白為抗原免疫OVX大鼠,成功治療了OVX大鼠的骨質疏松。末次免疫后第10天,OVX大鼠血清的抗體效價為1：128萬,說明我們以GST-hFSHβ重組蛋白為抗原免疫OVX大鼠,成功誘導大鼠產生了針對FSH的多克隆抗體,并且獲得了較高的抗體效價。骨密度(bone mineral density, BMD)檢測結果顯示治療組大鼠的BMD得到了顯著改善,6月時可達到Sham組的90%,12月時約為Sham組的85%,并且均顯著高于OVX組(P0.01)。Micro CT分析結果表明,GST-hFSHβ重組蛋白免疫治療后,OVX大鼠股骨的Bone Volume/Total Volume (BV/TV), Trabecular Thickness (Tb.Th)和Trabecular Number (Tb.N)均顯著高于OVX組,而Bone Surface Area/Bone Volume (BSA/BV), Trabecular Spacing (Tb.Sp)和Trabecular Pattern Factor(TPF)均顯著低于OVX組,說明在體免疫治療后,OVX大鼠的骨小梁丟失得到了明顯緩解,骨量顯著提高。三點彎曲(three-point bending test)和壓力實驗(compression test)實驗結果表明,免疫治療后,OVX大鼠皮質骨和松質骨的力學性質得到了顯著提高,并且該結果支持BMD檢測和Micro CT分析的結果。組織形態(tài)學檢測的結果也證實了力學檢測、BMD檢測和Micro CT分析的實驗結果,均顯示治療后OVX大鼠的骨小梁參數得到了顯著改善,并且抗酒石酸鹽酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase, TRAP)染色結果表明,GST-hFSHβ重組蛋白免疫治療后,OVX大鼠股骨生長板附近的破骨細胞數量顯著下降。生化分析以及ELISA檢測表明,治療組OVX大鼠的堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)、骨鈣素(osteocalcin, OC)、尿鈣(calcium, Ca)、尿磷(phosphorus, P)和尿脫氧吡啶酚(deoxypyridinoline, DPD)等絕經后骨質疏松相關參數的升高均得到了顯著抑制。 結論 使用基于FSHp的蛋白疫苗免疫OVX大鼠,能夠顯著緩解大鼠OVX誘發(fā)的骨質疏松,證實FSH信號轉導通路在性腺機能衰退導致的骨丟失中發(fā)揮重要作用,為使用基于FSH的抗絕經后骨質疏松蛋白疫苗治療人絕經后骨質疏松提供了動物實驗依據。
【學位授予單位】：西北大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R580;R392

【參考文獻】

相關期刊論文 前1條

1 呂榮;改進的麗春紅三色法[J];陜西新醫(yī)藥;1986年08期

相關博士學位論文 前1條

1 廖鳴娟;大熊貓等瀕危動物FSH/LH和GH/GHR基因的克隆及其表達研究[D];浙江大學;2003年

相關碩士學位論文 前1條

1 劉瓊;草魚促性腺激素基因原核表達及多克隆抗體的制備[D];湖南師范大學;2011年

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本文編號：2603885