【摘要】：骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis, OP)是一種以骨小梁減少、骨脆性增加為病理特征的代謝性骨病。在我國,約有2.1億人骨量低于正常標準,至少有近7000萬人患有骨質(zhì)疏松癥。其中絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病率占據(jù)了骨質(zhì)疏松總發(fā)病率的70%以上,由絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松引發(fā)的骨脆性骨折,致殘率和致死率均較高,嚴重威脅著中老年婦女的骨骼健康。因此,研制一種能夠有效治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的疫苗,能夠顯著提高中老年婦女生活質(zhì)量、降低社會和家庭負擔。 長期以來,雌激素(estrogen)缺乏被認為是誘發(fā)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的關(guān)鍵病因。激素替代療法(hormone replacement therapy, HRT),尤其是雌激素替代療法(estrogen replacement therapy, ERT)在臨床上的廣泛應(yīng)用,也確實取得了一定的效果。有研究表明,雌激素能夠通過下調(diào)IL-1、IL-6和TNF-α等炎癥因子抑制破骨細胞分化,進而抑制骨吸收。但是,單純的雌激素水平降低并不能充分解釋性腺機能衰退導致的骨丟失。使用基因敲除鼠的研究發(fā)現(xiàn),將雌激素受體a和β同時敲除的小鼠去勢(ovariectomy, OVX),小鼠僅發(fā)生了輕微的骨質(zhì)疏松,而單純敲除雌激素α或β受體,小鼠則具有正常的骨量。這說明雌激素缺乏并非絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的單一誘因。 研究發(fā)現(xiàn),若在去勢的同時摘除垂體(hypophysectomy),小鼠的骨量高于單純?nèi)莸男∈?這表明垂體分泌的激素在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松發(fā)生過程中發(fā)揮著非常關(guān)鍵的作用。垂體主要分泌卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone, FSH)和黃體生成素(luteinizing hormone, LH)。在圍絕經(jīng)期早期,FSH水平就已經(jīng)開始升高,并且FSH水平的升高與骨量的丟失相一致。但是,之前僅將FSH水平的升高作為絕經(jīng)開始的標志之一,而未將其認為是骨質(zhì)疏松的誘發(fā)因素。然而隨著研究的深入,發(fā)現(xiàn)圍絕經(jīng)期存在FSH血漿水平異常升高、FSH血漿濃度與骨丟失密切相關(guān)等現(xiàn)象。并且最近的研究發(fā)現(xiàn),FSH通過促進破骨細胞的形成,在骨質(zhì)疏松發(fā)生中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。Mone ZaiDi等人發(fā)現(xiàn)破骨細胞的表面存在卵泡刺激素受體(follicle-stimulating hormone receptor, FSHR), FSH能夠直接作用于破骨細胞表面的FSHR,激活MEK/Erk、NF-κB、Akt信號通路,促進破骨細胞的形成,進而促進骨吸收,調(diào)節(jié)骨量。這些研究結(jié)果均提示,FSH是誘發(fā)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的關(guān)鍵病因。 因此,我們認為阻斷FSH與FSHR的結(jié)合,能夠有效地治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松。 方法 基于Mone ZaiDi等人的研究結(jié)果,我們設(shè)計了針對FSH的絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松蛋白疫苗,并進行了體外實驗和體內(nèi)實驗： (1)檢測外源性FSH對于破骨細胞分化和成骨細胞分化的影響。在破骨細胞誘導分化過程中和成骨細胞誘導分化過程中外源性加入FSH,檢測其在不同濃度條件下對破骨細胞分化和成骨細胞分化的影響。 (2)制備GST-hFSHβ重組蛋白。利用大腸桿菌對于密碼子的偏愛性,優(yōu)化人FSHp亞基(human FSH β subunit, hFSHβ)的成熟肽編碼序列。通過化學合成的方法獲得優(yōu)化后的hFSHβ基因,并通過BamH I-EcoR I酶切位點克隆至pGEX-4T-1原核表達載體。IPTG誘導表達后,利用GSTrap親和層析柱純化GST-hFSHβ重組蛋白,并通過透析、冷凍干燥等方法,進行蛋白的除鹽、濃縮和定量。 (3)以GST-hFSHβ重組蛋白為抗原免疫OVX大鼠,以期治療OVX大鼠的骨質(zhì)疏松。將GST-hFSHβ重組蛋白與弗氏佐劑等體積混合后,皮下注射(subcutaneously, s.c.)免疫OVX大鼠,并通過Micro CT分析、三點彎曲實驗、壓力實驗、組織形態(tài)學檢測和血尿生化分析.ELISA檢測等方法,評價以GST-hFSHβ重組蛋白為抗原免疫OVX大鼠對于OVX大鼠骨質(zhì)疏松的治療情況。 結(jié)果 通過體外和體內(nèi)實驗,我們獲得了如下實驗結(jié)果： (1)外源性FSH能夠以劑量依賴方式促進破骨細胞分化,且該作用能夠被抗hFSHβ抗血清阻斷。在骨髓單核細胞向破骨細胞誘導分化過程中,外源性加入3ng/mL、10ng/mL和30ng/mL的FSH,發(fā)現(xiàn)外源性FSH對于細胞生長狀態(tài)無明顯影響的同時,破骨細胞分化的數(shù)量以及破骨細胞細胞核形成的數(shù)量對于FSH濃度均呈劑量依賴性升高,且在較低濃度(3ng/mL)時即可有明顯的促進作用。在破骨細胞誘導分化過程中,加入抗hFSHβ抗血清,發(fā)現(xiàn)高濃度FSH (30ng/mL)對于破骨細胞分化的促進作用被阻斷。 (2)成功在大腸桿菌內(nèi)表達GST-hFSHβ重組蛋白。通過刪除hFSHβ信號肽序列、利用大腸桿菌偏愛密碼子對hFSHβ成熟肽核酸序列進行優(yōu)化以及對蛋白誘導表達條件(IPTG濃度、誘導時間、誘導溫度、轉(zhuǎn)速)進行優(yōu)化等方法,提高蛋白表達量。以優(yōu)化后的條件表達GST-hFSHβ重組蛋白,蛋白表達量可達到菌體總蛋白的31.4%。通過GSTrap親和層析柱純化、透析、冷凍干燥,獲得了干燥的GST-hFSHβ重組蛋白。 (3)以GST-hFSHβ重組蛋白為抗原免疫OVX大鼠,成功治療了OVX大鼠的骨質(zhì)疏松。末次免疫后第10天,OVX大鼠血清的抗體效價為1：128萬,說明我們以GST-hFSHβ重組蛋白為抗原免疫OVX大鼠,成功誘導大鼠產(chǎn)生了針對FSH的多克隆抗體,并且獲得了較高的抗體效價。骨密度(bone mineral density, BMD)檢測結(jié)果顯示治療組大鼠的BMD得到了顯著改善,6月時可達到Sham組的90%,12月時約為Sham組的85%,并且均顯著高于OVX組(P0.01)。Micro CT分析結(jié)果表明,GST-hFSHβ重組蛋白免疫治療后,OVX大鼠股骨的Bone Volume/Total Volume (BV/TV), Trabecular Thickness (Tb.Th)和Trabecular Number (Tb.N)均顯著高于OVX組,而Bone Surface Area/Bone Volume (BSA/BV), Trabecular Spacing (Tb.Sp)和Trabecular Pattern Factor(TPF)均顯著低于OVX組,說明在體免疫治療后,OVX大鼠的骨小梁丟失得到了明顯緩解,骨量顯著提高。三點彎曲(three-point bending test)和壓力實驗(compression test)實驗結(jié)果表明,免疫治療后,OVX大鼠皮質(zhì)骨和松質(zhì)骨的力學性質(zhì)得到了顯著提高,并且該結(jié)果支持BMD檢測和Micro CT分析的結(jié)果。組織形態(tài)學檢測的結(jié)果也證實了力學檢測、BMD檢測和Micro CT分析的實驗結(jié)果,均顯示治療后OVX大鼠的骨小梁參數(shù)得到了顯著改善,并且抗酒石酸鹽酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase, TRAP)染色結(jié)果表明,GST-hFSHβ重組蛋白免疫治療后,OVX大鼠股骨生長板附近的破骨細胞數(shù)量顯著下降。生化分析以及ELISA檢測表明,治療組OVX大鼠的堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)、骨鈣素(osteocalcin, OC)、尿鈣(calcium, Ca)、尿磷(phosphorus, P)和尿脫氧吡啶酚(deoxypyridinoline, DPD)等絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松相關(guān)參數(shù)的升高均得到了顯著抑制。 結(jié)論 使用基于FSHp的蛋白疫苗免疫OVX大鼠,能夠顯著緩解大鼠OVX誘發(fā)的骨質(zhì)疏松,證實FSH信號轉(zhuǎn)導通路在性腺機能衰退導致的骨丟失中發(fā)揮重要作用,為使用基于FSH的抗絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松蛋白疫苗治療人絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松提供了動物實驗依據(jù)。
【學位授予單位】：西北大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R580;R392

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 呂榮;改進的麗春紅三色法[J];陜西新醫(yī)藥;1986年08期

相關(guān)博士學位論文 前1條

1 廖鳴娟;大熊貓等瀕危動物FSH/LH和GH/GHR基因的克隆及其表達研究[D];浙江大學;2003年

相關(guān)碩士學位論文 前1條

1 劉瓊;草魚促性腺激素基因原核表達及多克隆抗體的制備[D];湖南師范大學;2011年

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本文編號：2603885