【摘要】：肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子是由日本學(xué)者Nakamura等從部分肝切除大鼠的肝臟中分離到一種能刺激原代培養(yǎng)的肝細(xì)胞DNA合成和生長(zhǎng)的蛋白質(zhì)因子，首次將之命名為肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（Hepatocyte Growth Factor）HGF在目前已知的生長(zhǎng)因子中是最強(qiáng)的促肝細(xì)胞分裂劑。現(xiàn)已證明HGF廣泛分布于肝、腎、脾肺、腦、胰腺、甲狀腺、唾液腺等處，是一種多效性因子，具有多種生物學(xué)功能，如促細(xì)胞分裂劑（mitogen）、促細(xì)胞運(yùn)動(dòng)劑（motogen）和促形態(tài)形成劑（morphogen）等作用 。它不僅能特異性地刺激肝細(xì)胞DNA的合成,還可促進(jìn)肺、腎、胰腺、膠質(zhì)細(xì)胞等多種內(nèi)皮和上皮細(xì)胞的分裂、分化及形態(tài)發(fā)生，參與機(jī)體重要組織器官損傷后的修復(fù)。隨著人們對(duì)肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子研究的深入，如肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系、作用機(jī)制與臨床應(yīng)用價(jià)值等方面的研究， HGF的重要性日益受到了人們的關(guān)注。近年來(lái)，無(wú)論是在基礎(chǔ)研究還是在開(kāi)發(fā)應(yīng)用研究領(lǐng)域均取得了較大進(jìn)展。國(guó)內(nèi)外研究人員都在積極探索獲得HGF的方法和途徑。在80年代末期，國(guó)外即開(kāi)始嘗試從病人血清或大鼠血清，血小板及肝臟中進(jìn)行了HGF的分離純化，并在其結(jié)構(gòu)、功能和生物學(xué)特性等方面也做了較為深入的研究，取得了多方面的成功。隨著研究的深入，特別是臨床藥用研究的開(kāi)展，對(duì)HGF需求量日益增加，但從含量甚微的組織中提取活性HGF生產(chǎn)工藝，過(guò)程復(fù)雜，成本昂貴，產(chǎn)量甚微，缺乏實(shí)際意義。因此，由于來(lái)源的匱乏使其廣泛應(yīng)用極受限制。我們采用基因工程的方法表達(dá)目的基因，探索了建立高效表達(dá)和生產(chǎn)有野生活性的HGF基因工程表達(dá)體系的可能性。不同蛋白在不同系統(tǒng)中表達(dá)水平有顯著差異，所以選擇一種合適的表達(dá)系統(tǒng)對(duì)蛋白表達(dá)水平非常關(guān)鍵，我們比較哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)體系、酵母表達(dá)體系、原核表達(dá)體系中HGF的表達(dá)水平及表達(dá)產(chǎn)物的生物學(xué)作用。 作為一種多效性生長(zhǎng)因子，具有多種生物學(xué)功能，HGF分別可促進(jìn)人大動(dòng)脈及大鼠冠狀動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞的DNA合成，促進(jìn)其增殖，但對(duì)血管平滑肌細(xì)胞的DNA合成則無(wú)影響。HGF的促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖作用與血管內(nèi) WP=6 皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子VEGF（vascular endothelial growth factor）相似，HGF可以增強(qiáng)VEGF導(dǎo)致的血管內(nèi)皮增生。心絞痛、心肌梗塞的病理基礎(chǔ)是血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷、血管平滑肌細(xì)胞增殖纖維化造成的冠狀動(dòng)脈狹窄。血管內(nèi)皮細(xì)胞有抗血栓，抑制平滑肌細(xì)胞增殖的作用，這些作用使其成為機(jī)體心血管系統(tǒng)防病的屏障。HGF以其促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增生的作用使其極有可能用于臨床來(lái)治療血管外傷、防止冠狀動(dòng)脈血管術(shù)后狹窄、防止和治療動(dòng)脈硬化，以其抗纖維化作用而用于心肌梗塞。我們探討了HGF基因的自分泌表達(dá)對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖作用，為心肌缺血的基因治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本文作了以下幾方面的研究工作，并取得相應(yīng)的結(jié)果如下： 第一部分：我們借鑒HGF分子自身合成加工特點(diǎn)，，提出對(duì)HGFcDNA進(jìn)行轉(zhuǎn)錄前加工和修飾，探索了分別構(gòu)建HGFα鏈、β鏈原核高效表達(dá)體系，采用異源蛋白共復(fù)性技術(shù)獲得有活性人肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子的技術(shù)路線(xiàn)，探討利用原核細(xì)胞基因工程體系獲得有活性hHGF的可能性。 （1）分別構(gòu)建rhHGFα鏈、β鏈表達(dá)載體,并采用限制性?xún)?nèi)切酶酶切圖譜法鑒定rhHGFα鏈、β鏈表達(dá)載體的質(zhì)粒,酶切鑒定結(jié)果與預(yù)期一致。 （2）SDS-PAGE檢測(cè)工程菌表達(dá)產(chǎn)物的分子量與預(yù)期相符；Western Blot檢測(cè)結(jié)果正確。 （3）研究發(fā)酵工藝，研究了不同培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)時(shí)間、誘導(dǎo)持續(xù)時(shí)間和分批補(bǔ)料對(duì)菌體生長(zhǎng)和蛋白表達(dá)量的影響，得到優(yōu)化的工程菌培養(yǎng)與誘導(dǎo)表達(dá)條件。 （4）進(jìn)一步進(jìn)行包涵體分離純化研究：分別研究了不同的細(xì)胞破碎工藝、包涵體洗滌和純化工藝，得到優(yōu)化的工藝路線(xiàn)為：超聲波破碎、4M尿素洗滌，8M尿素溶解。 （5）建立層析純化工藝，產(chǎn)物純度達(dá)95%。 （6）復(fù)性樣品經(jīng)層析純化后進(jìn)行活性測(cè)定，采用MTT法測(cè)定復(fù)性樣品對(duì)原代培養(yǎng)成年大鼠肝細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果表明表達(dá)產(chǎn)物具有刺激肝細(xì)胞生長(zhǎng)的活性。 第二部分：建立了HGF哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)株，具體結(jié)果如下： 以pRC-CMV作為真核細(xì)胞表達(dá)載體，構(gòu)建含 HGFcDNA全系列的表達(dá)載體pRC/CMV-HGF。經(jīng)篩選及限制性?xún)?nèi)切酶譜鑒定重組正確。 WP=7 以磷酸鈣－DNA共沉淀法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞（CHO），以800μg/ml的選擇壓力用G418進(jìn)行篩選15天左右，獲得陽(yáng)性克隆。 將細(xì)胞克隆在200μg/ml G418濃度下維持篩選，擴(kuò)大培養(yǎng)。用原代培養(yǎng)成年大鼠肝細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)基上清進(jìn)行活性測(cè)定。3H-TdR摻入分析證明，陽(yáng)性克隆培養(yǎng)基上清可以明顯刺激鼠肝細(xì)胞DNA的合成。表明重組人HGF基因在宿主細(xì)胞CHO中得到正確的轉(zhuǎn)錄和翻譯，并將有生物活性的表達(dá)產(chǎn)物分泌到培養(yǎng)基中。 第三部分：研究HGF甲醇營(yíng)養(yǎng)型酵母—巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)中的分泌表達(dá)。 將HGF基因克隆到克隆載體pMD18－T 上，經(jīng)酶切鑒定和序列測(cè)定鑒定正確后，再將HGF基因克隆到酵母表達(dá)載體pPIC9K上，得到重組質(zhì)粒：pPIC9K－HGF，經(jīng)酶切鑒定構(gòu)建正確。 （2） 利用電轉(zhuǎn)化方法，將重組質(zhì)粒pPIC9K－HGF轉(zhuǎn)化巴斯德畢赤酵母KM71,提取已轉(zhuǎn)化的酵母基因組DNA，PCR鑒定篩選陽(yáng)性重組子。 （3） 通過(guò)搖瓶誘導(dǎo)培養(yǎng)試驗(yàn)獲得表達(dá)水平較高的工程菌.培養(yǎng)
【圖文】：

HGF合成的加工成熟過(guò)程示意圖

山西醫(yī)程菌誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化 工程菌生長(zhǎng)曲線(xiàn)的制備及誘導(dǎo)起始時(shí)間的優(yōu)化1.HGFα工程菌生長(zhǎng)曲線(xiàn)的制備及誘導(dǎo)時(shí)間的優(yōu)化繪制工程菌 30℃生長(zhǎng)曲線(xiàn)，根據(jù)生長(zhǎng)曲線(xiàn)（圖 2-7）以較快的特點(diǎn)，將 30℃培養(yǎng)時(shí)間調(diào)整為 4.5h，42℃誘導(dǎo)時(shí)的蛋白得到高效表達(dá)（圖 2-8）。600
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2004
【分類(lèi)號(hào)】：Q78

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 陳建軍,孫苗,陳常慶,盧芳,王德寶;含P_R啟動(dòng)子的原核高效表達(dá)載體的構(gòu)建及應(yīng)用[J];生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展;1999年05期

本文編號(hào)：2603323