【摘要】：肝細胞生長因子是由日本學者Nakamura等從部分肝切除大鼠的肝臟中分離到一種能刺激原代培養(yǎng)的肝細胞DNA合成和生長的蛋白質(zhì)因子，首次將之命名為肝細胞生長因子（Hepatocyte Growth Factor）HGF在目前已知的生長因子中是最強的促肝細胞分裂劑�，F(xiàn)已證明HGF廣泛分布于肝、腎、脾肺、腦、胰腺、甲狀腺、唾液腺等處，是一種多效性因子，具有多種生物學功能，如促細胞分裂劑（mitogen）、促細胞運動劑（motogen）和促形態(tài)形成劑（morphogen）等作用 。它不僅能特異性地刺激肝細胞DNA的合成,還可促進肺、腎、胰腺、膠質(zhì)細胞等多種內(nèi)皮和上皮細胞的分裂、分化及形態(tài)發(fā)生，參與機體重要組織器官損傷后的修復。隨著人們對肝細胞生長因子研究的深入，如肝細胞生長因子結構與功能的關系、作用機制與臨床應用價值等方面的研究， HGF的重要性日益受到了人們的關注。近年來，無論是在基礎研究還是在開發(fā)應用研究領域均取得了較大進展。國內(nèi)外研究人員都在積極探索獲得HGF的方法和途徑。在80年代末期，國外即開始嘗試從病人血清或大鼠血清，血小板及肝臟中進行了HGF的分離純化，并在其結構、功能和生物學特性等方面也做了較為深入的研究，取得了多方面的成功。隨著研究的深入，特別是臨床藥用研究的開展，對HGF需求量日益增加，但從含量甚微的組織中提取活性HGF生產(chǎn)工藝，過程復雜，成本昂貴，產(chǎn)量甚微，缺乏實際意義。因此，由于來源的匱乏使其廣泛應用極受限制。我們采用基因工程的方法表達目的基因，探索了建立高效表達和生產(chǎn)有野生活性的HGF基因工程表達體系的可能性。不同蛋白在不同系統(tǒng)中表達水平有顯著差異，所以選擇一種合適的表達系統(tǒng)對蛋白表達水平非常關鍵，我們比較哺乳動物細胞表達體系、酵母表達體系、原核表達體系中HGF的表達水平及表達產(chǎn)物的生物學作用。 作為一種多效性生長因子，具有多種生物學功能，HGF分別可促進人大動脈及大鼠冠狀動脈血管內(nèi)皮細胞的DNA合成，促進其增殖，但對血管平滑肌細胞的DNA合成則無影響。HGF的促進血管內(nèi)皮細胞增殖作用與血管內(nèi) WP=6 皮細胞生長因子VEGF（vascular endothelial growth factor）相似，HGF可以增強VEGF導致的血管內(nèi)皮增生。心絞痛、心肌梗塞的病理基礎是血管內(nèi)皮細胞的損傷、血管平滑肌細胞增殖纖維化造成的冠狀動脈狹窄。血管內(nèi)皮細胞有抗血栓，抑制平滑肌細胞增殖的作用，這些作用使其成為機體心血管系統(tǒng)防病的屏障。HGF以其促進血管內(nèi)皮細胞增生的作用使其極有可能用于臨床來治療血管外傷、防止冠狀動脈血管術后狹窄、防止和治療動脈硬化，以其抗纖維化作用而用于心肌梗塞。我們探討了HGF基因的自分泌表達對血管內(nèi)皮細胞的增殖作用，為心肌缺血的基因治療提供實驗依據(jù)。本文作了以下幾方面的研究工作，并取得相應的結果如下： 第一部分：我們借鑒HGF分子自身合成加工特點，，提出對HGFcDNA進行轉錄前加工和修飾，探索了分別構建HGFα鏈、β鏈原核高效表達體系，采用異源蛋白共復性技術獲得有活性人肝細胞生長因子的技術路線，探討利用原核細胞基因工程體系獲得有活性hHGF的可能性。 （1）分別構建rhHGFα鏈、β鏈表達載體,并采用限制性內(nèi)切酶酶切圖譜法鑒定rhHGFα鏈、β鏈表達載體的質(zhì)粒,酶切鑒定結果與預期一致。 （2）SDS-PAGE檢測工程菌表達產(chǎn)物的分子量與預期相符；Western Blot檢測結果正確。 （3）研究發(fā)酵工藝，研究了不同培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)時間、誘導持續(xù)時間和分批補料對菌體生長和蛋白表達量的影響，得到優(yōu)化的工程菌培養(yǎng)與誘導表達條件。 （4）進一步進行包涵體分離純化研究：分別研究了不同的細胞破碎工藝、包涵體洗滌和純化工藝，得到優(yōu)化的工藝路線為：超聲波破碎、4M尿素洗滌，8M尿素溶解。 （5）建立層析純化工藝，產(chǎn)物純度達95%。 （6）復性樣品經(jīng)層析純化后進行活性測定，采用MTT法測定復性樣品對原代培養(yǎng)成年大鼠肝細胞增殖的影響，結果表明表達產(chǎn)物具有刺激肝細胞生長的活性。 第二部分：建立了HGF哺乳動物細胞表達株，具體結果如下： 以pRC-CMV作為真核細胞表達載體，構建含 HGFcDNA全系列的表達載體pRC/CMV-HGF。經(jīng)篩選及限制性內(nèi)切酶譜鑒定重組正確。 WP=7 以磷酸鈣－DNA共沉淀法將重組質(zhì)粒轉染中國倉鼠卵巢細胞（CHO），以800μg/ml的選擇壓力用G418進行篩選15天左右，獲得陽性克隆。 將細胞克隆在200μg/ml G418濃度下維持篩選，擴大培養(yǎng)。用原代培養(yǎng)成年大鼠肝細胞對培養(yǎng)基上清進行活性測定。3H-TdR摻入分析證明，陽性克隆培養(yǎng)基上清可以明顯刺激鼠肝細胞DNA的合成。表明重組人HGF基因在宿主細胞CHO中得到正確的轉錄和翻譯，并將有生物活性的表達產(chǎn)物分泌到培養(yǎng)基中。 第三部分：研究HGF甲醇營養(yǎng)型酵母—巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)中的分泌表達。 將HGF基因克隆到克隆載體pMD18－T 上，經(jīng)酶切鑒定和序列測定鑒定正確后，再將HGF基因克隆到酵母表達載體pPIC9K上，得到重組質(zhì)粒：pPIC9K－HGF，經(jīng)酶切鑒定構建正確。 （2） 利用電轉化方法，將重組質(zhì)粒pPIC9K－HGF轉化巴斯德畢赤酵母KM71,提取已轉化的酵母基因組DNA，PCR鑒定篩選陽性重組子。 （3） 通過搖瓶誘導培養(yǎng)試驗獲得表達水平較高的工程菌.培養(yǎng)
【圖文】：

HGF合成的加工成熟過程示意圖

山西醫(yī)程菌誘導表達條件的優(yōu)化 工程菌生長曲線的制備及誘導起始時間的優(yōu)化1.HGFα工程菌生長曲線的制備及誘導時間的優(yōu)化繪制工程菌 30℃生長曲線，根據(jù)生長曲線（圖 2-7）以較快的特點，將 30℃培養(yǎng)時間調(diào)整為 4.5h，42℃誘導時的蛋白得到高效表達（圖 2-8）。600
【學位授予單位】：山西醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2004
【分類號】：Q78

【參考文獻】

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1 陳建軍,孫苗,陳常慶,盧芳,王德寶;含P_R啟動子的原核高效表達載體的構建及應用[J];生物化學與生物物理進展;1999年05期

本文編號：2603323