發(fā)布時(shí)間：2020-03-25 22:20

【摘要】：近年來對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)再生能力的認(rèn)識(shí)逐漸深入,發(fā)現(xiàn)移植外周神經(jīng)雪旺細(xì)胞 (Schwann cells SCs)、嗅成鞘細(xì)胞(Olfactory ensheathing cells OECs)均可以促進(jìn)中樞軸 突再生,并且發(fā)現(xiàn) OECs 脊髓移植促軸突再生效果優(yōu)于 SCs,表現(xiàn)在再生軸突的延伸 距離、電生理及支持體重和運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)等方面。OECs 抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)的 能力和較強(qiáng)的細(xì)胞遷移能力可能起了一定的作用,可能還有另外的一些未被發(fā)現(xiàn)的因 素在同時(shí)起作用。 嗅覺系統(tǒng)終生保持著神經(jīng)再生的能力,嗅神經(jīng)元存活周期為 4-8 周,衰老的神經(jīng) 元由嗅上皮產(chǎn)生的新生神經(jīng)元取代,重新發(fā)出軸突進(jìn)入中樞的嗅球與靶細(xì)胞形成突觸。 OECs 是伴隨嗅神經(jīng)形成髓鞘的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞,與嗅神經(jīng)再生進(jìn)入嗅球同靶細(xì)胞形成 突觸密切相關(guān),。OECs 在形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能上與 SCs 極為相似,體外培養(yǎng)兩者均可呈梭 形,可以形成髓鞘,都可以分泌多種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子如神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nerve growth factor NGF)、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain derived neurotrophic factor BDNF)和睫狀神經(jīng)生長(zhǎng)因 子(ciliary-derived nerve growth factor CNTF)。這兩種細(xì)胞既相似又不同,為我們研究 神經(jīng)再生提供了一個(gè)新的思路,兩者進(jìn)行比較可能發(fā)現(xiàn)有利于中樞神經(jīng)再生的某些分 子。 本研究以 OECs 和 SCs 為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,采用免疫溶解法獲得兩種細(xì)胞的純培養(yǎng),應(yīng) 用免疫細(xì)胞化學(xué)(ICC)和電鏡技術(shù)觀察 OECs 的抗原表達(dá)以及形態(tài)特征。利用抑制消減 雜交技術(shù)(SSH)篩選兩者的差異表達(dá)基因,從兩者的差異表達(dá)基因中分析與中樞神經(jīng)再 生相關(guān)的基因表達(dá),為進(jìn)一步闡述中樞神經(jīng)再生機(jī)制創(chuàng)造條件。主要結(jié)果如下: 1.免疫溶解法獲得 OECs 和 SCs 的純培養(yǎng) 免疫溶解法純化 2h 可見懸浮細(xì)胞增多,純化后 24h 倒置顯微鏡下觀察成纖維細(xì) 胞少見,P75NGFr 免疫組化顯示 OECs 純度可達(dá) 95%以上;繼續(xù)培養(yǎng) 6d 后再次進(jìn)行 純化可去除大部分新增殖的成纖維細(xì)胞,保持 OECs 純度在 95%以上。 2.ICC 技術(shù)研究 OECs 的抗原表達(dá),電鏡技術(shù)觀察 OECs 的超微結(jié)構(gòu)特征 OECs 免疫組化結(jié)果顯示:P75LNGFr(+),GFAP(+),NCAM(+),CDK5(-)。 免疫 細(xì)胞化學(xué)特征為:P75LNGFr 染色均勻分布于整個(gè)細(xì)胞和突起,核區(qū)較為淺淡;GFAP 染色較深分布于整個(gè)胞漿和突起;NCAM 免疫陽(yáng)性細(xì)胞表面均有分布。SEM 顯示 OECs 4 WP=9 第三軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文 核不規(guī)則,呈分葉狀或齒狀,核仁明顯,染色質(zhì)均勻分布于核中,異染色質(zhì)可在核膜 下形成塊狀結(jié)構(gòu)。 3.SSH 技術(shù)篩選 OECs 和 SCs 的差異表達(dá)基因 測(cè)序結(jié)果得到了 4 個(gè)不同的已知基因,分別編碼:肝白血病因子(hepatic leukemia factor Hlf),糖基化磷脂酰肌醇磷脂酶 D1(Glycosylphosphatidylinositol phospholipase D1 GPLD1),Phr1(PAM)和縫隙連接蛋白亞單位 connexin43。在 4 個(gè)已知基因中,phr1 和 hlf 與突觸形成相關(guān);縫隙連接蛋白亞單位 connexin43 參與細(xì)胞間的信號(hào)傳遞;GPLD1 可能參與調(diào)節(jié) GPI 錨定蛋白的功能。 GPLD1 在 OECs 表達(dá)可能有利于裂解抑制軸突生長(zhǎng)的 GPI 錨定蛋白,通過消除這 些蛋白的抑制作用來促進(jìn)軸突再生。phr1、hlf 和 Gja1(connexin43)則可能參與 OECs 與軸突之間的信息交流和調(diào)控,影響軸突的生長(zhǎng)。
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2004
【分類號(hào)】：R329

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本文編號(hào)：2600528