【摘要】： 豬器官、組織和細(xì)胞作為臨床移植的供體源具有廣泛和良好的前景，可緩解臨床器官移植的器官相對(duì)短缺，也可為臨床治療Ⅰ-型胰島素依賴(lài)型糖尿病，帕金森病、亨廷頓病、癲癇病等頑固性神經(jīng)疾患提供一種治療方法，并可作為治療急性爆發(fā)性肝炎肝功能衰竭、急、慢性腎功能衰竭的過(guò)渡性措施。自Dr．Clive Patience(BioTransplant Inc．首席科學(xué)家)1997年報(bào)道豬內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒(PERV)感染體外培養(yǎng)人細(xì)胞以來(lái)，豬異種移植過(guò)程中可能發(fā)生PERV種間傳播的潛在危險(xiǎn)已引起眾多學(xué)者的廣泛關(guān)注。 Patience等首先證實(shí)至少有三個(gè)PERV亞型在體外培養(yǎng)能感染人細(xì)胞，Takeuchi等通過(guò)假型實(shí)驗(yàn)也證實(shí)PERV感染體外培養(yǎng)人細(xì)胞株，Martin等通過(guò)感染性實(shí)驗(yàn)證實(shí)了PERV感染體外培養(yǎng)人細(xì)胞。以后許多學(xué)者從多方面對(duì)PERV的生物學(xué)特性進(jìn)行了較為廣泛和深入的研究。 目前已經(jīng)證實(shí)豬內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒為典型的哺乳動(dòng)物C型逆轉(zhuǎn)錄病毒，并具有g(shù)ag-pol-env基因組結(jié)構(gòu)。Patience等從兩株豬腎細(xì)胞株分離得到的天然病毒粒子，證實(shí)為典型的哺乳類(lèi)C型逆轉(zhuǎn)錄病毒。Akiyoshi等鑒定小型豬淋巴細(xì)胞PERV(PERV-MSL)全長(zhǎng)cDNA核酸序列，證實(shí)PERV-MSL是一種典型的C型逆轉(zhuǎn)錄病毒，其長(zhǎng)度為8132bp，與長(zhǎng)臂猿白血病病毒和鼠白血病病毒具有最大的核酸序列同源性。同時(shí)在多種豬器官和正常白細(xì)胞檢出PERV-MSL RNA的結(jié)構(gòu)產(chǎn)物。PERV-MSL的gag、pol、env的ORF氨基酸序列與Tsukuba-1逆轉(zhuǎn)錄病毒氨基酸序列的同源性＞99％，與胎豬腎細(xì)胞PERV(PK15-PERV)氨基酸序列具有高度同源性。我國(guó)豬種資源豐富，國(guó)內(nèi)尚未開(kāi)展豬內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒生物學(xué)方面的實(shí)驗(yàn)研究。 體外實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)了豬PERV對(duì)人細(xì)胞具有感染性，但在體感染性研 究報(bào)道甚少。Van der Laan等通過(guò)建立非肥胖性糖尿�。瘒�(yán)重聯(lián)合免疫缺陷 wOD用CID鼠胰島細(xì)胞移植模型，首先證實(shí)豬胰島細(xì)胞產(chǎn)生PERV，并在 體外培養(yǎng)感染人細(xì)胞，并移植至NOD侶 鼠，檢測(cè)鼠組織PEM RNA 的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)多種組織發(fā)生PERV感染，這是移植豬組織后體內(nèi)PERV 主動(dòng)復(fù)制，也是在體種間交叉感染的首次報(bào)道。后來(lái)Deng等建立SCID鼠 移植胎豬胰島細(xì)胞模型，將胎豬胰島移植于 SCID鼠，飼養(yǎng) 3＊ 周分別處 死。取肝、脾、腦提取 DNA和 RNA，應(yīng)用巢式 PCR和 RTPCR檢查 PEM 和擴(kuò)增豬線粒體細(xì)胞色素氧化酶亞單位＊基因o），結(jié)果發(fā)現(xiàn)M4－肝和 M19－脾組織的PERV陽(yáng)性，COil陰性，這提示豬PERV向鼠組織傳播己經(jīng) 發(fā)生，但檢測(cè) PERV RNA未發(fā)現(xiàn)鼠組織有活躍的 PERV復(fù)制的證據(jù)。這些 結(jié)果初步表明豬細(xì)胞可以在體感染鼠組織。而近期有幾宗接受活豬組織或 細(xì)胞移植的臨床病例的文獻(xiàn)報(bào)道，但所有報(bào)道均表明未發(fā)現(xiàn)PERV感染的 證據(jù)。臨床結(jié)果與實(shí)驗(yàn)結(jié)果并不完全一致，因此PERV的在體感染性尚末 到廣泛的公認(rèn)，有待進(jìn)一步深入研究。 為此，本課題擬從豬外周血白細(xì)胞基因組存在的PERV基因序列及其 差異性、各種豬組織PERV基因序列的mRNA豐度、豬皮膚成纖維細(xì)胞 對(duì)人HEK293細(xì)胞的體外感染性和對(duì)SCID鼠的在體感染性入手，研究我 國(guó)豬PERV的生物學(xué)特性、豬組織PERV的表達(dá)的高低幅度（高表達(dá)和低表 達(dá)）及豬皮膚成纖維細(xì)胞PERV的體外和體內(nèi)感染性，從而為豬－人間異種 移植積累資料，為臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為異種移植的生物安全性評(píng)價(jià) 奠定基礎(chǔ)。研究?jī)?nèi)容分為以下三部分：＊）豬外周血白細(xì)胞DNA豬內(nèi)源性 逆轉(zhuǎn)錄病毒序列的檢測(cè)及差異性分析。主要了解我國(guó)豬資源的PERV生物 學(xué)特性，，為豬異種移植積累資料。p）兩種小型豬不同組織 PERV m洲A 豐度及其差異分析。了解備種組織PERV表達(dá)情況，以尋找PERV高表達(dá) 和低表達(dá)器官或組織，為臨床豬異種移植選擇組織或器官提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 O）豬皮膚成纖維細(xì)胞PERV的體外和體內(nèi)感染性實(shí)驗(yàn)研究。通過(guò)實(shí)驗(yàn)了 解豬皮膚成纖維細(xì)胞PERV的對(duì)人HEK293細(xì)胞的體外感染性和對(duì)SCID 鼠的體內(nèi)感染性，為豬異種移植提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 ·x· 本研究應(yīng)用PCR、PCR－RFLP、SS－SSCP等技術(shù)分析12個(gè)品系豬外周 血白細(xì)胞基因組DNA的PERV基因序列片段及其差異，應(yīng)用RT－PCR方 法分析廣西巴馬小型香豬和貴州小型香豬13種組織P＊RV基因序列m RNRNA 的表達(dá)及其差異，應(yīng)用組織細(xì)胞培養(yǎng)方法、免疫組織化學(xué)、電鏡技術(shù)建立 和鑒定豬皮膚成纖維細(xì)胞系，并將豬皮膚成纖維細(xì)胞與經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)染的具有抗 新霉素基因的人neo／HEK293細(xì)胞共培養(yǎng)，或?qū)⒇i皮膚成纖維細(xì)胞移植于 SCID 鼠，探討豬內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒的體外和體內(nèi)感染性，獲得以下結(jié)果 和結(jié)論： 1．口個(gè)品系豬外周血白細(xì)胞 DNA池基因組普遍存在 PERV－A、 PERVI、PERV gag基因序列，分析各品系個(gè)體發(fā)現(xiàn)PERV（基因序列的 檢出率約為 10％。應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄病毒逆轉(zhuǎn)錄酶基因高度保守區(qū)序列為引物， 尋找新的逆轉(zhuǎn)錄病毒序列，未能發(fā)現(xiàn)新的逆轉(zhuǎn)錄病毒序列；應(yīng)用SS七SCP 技術(shù)分析 12個(gè)品系豬外周血白細(xì)胞基因組擴(kuò)增產(chǎn)
【圖文】：

PMpL4FM3FM7FL:0PKCNM1543b黑5]sbP337bl)237bp圖版21皮下移植豬細(xì)胞SCID鼠組織DNACOH基因序列片段檢測(cè)K一15細(xì)胞2#鼠肌組織pL4:注射pK一15細(xì)胞4州鼠肺FM3:注射pSF細(xì)胞3#鼠肌7#鼠肌組織FLI。:注射PsF細(xì)胞l。#鼠肌組織PK:PK一15細(xì)胞M:PC訓(xùn)alkerCPHIPSZFH，F(xiàn)KZFS;FL;FSSFH6FX7FKsFKgFH一oCNM
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2002
【分類(lèi)號(hào)】：R363

【引證文獻(xiàn)】

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 張立;豬內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒分子特性的研究及抗病毒位點(diǎn)的選擇[D];四川大學(xué);2007年

本文編號(hào)：2597402