【摘要】： 本博士論文工作的主要貢獻(xiàn)為發(fā)展了蛋白質(zhì)凝膠內(nèi)酶切方法以及膠內(nèi)酶切產(chǎn)物的在線預(yù)濃縮技術(shù)；另外對(duì)新型介孔無(wú)機(jī)材料在MALDI中的應(yīng)用也進(jìn)行了研究；利用基于雙向電泳和生物質(zhì)譜的方法策略對(duì)缺血心肌線粒體以及高、低轉(zhuǎn)移潛能肝癌組織進(jìn)行了差異蛋白質(zhì)組分析。 后基因組學(xué)的主要流派蛋白質(zhì)組學(xué)目前顯得相當(dāng)活躍。蛋白質(zhì)組學(xué)分離和分析細(xì)胞與組織的全部蛋白并直接找到一組或幾組功能蛋白，并研究它們與功能基因(組)的內(nèi)在聯(lián)系 。在目前功能基因尚不很清楚的情況下，直接發(fā)現(xiàn)功能蛋白組具有重要的意義。目前，蛋白質(zhì)組學(xué)的研究主要集中在通過(guò)對(duì)蛋白質(zhì)性質(zhì)、豐度的考察來(lái)揭示它的功能，進(jìn)而找到與人類重大疾病相關(guān)的差異蛋白，使之成為藥物篩選的靶分子，，指導(dǎo)基因組的分析，而不是僅僅尾隨DNA序列分析的結(jié)果。 蛋白質(zhì)組學(xué)也正在成為分析化學(xué)研究領(lǐng)域的最前沿研究而蛋白質(zhì)組學(xué)的科學(xué)研究之所以能夠取得蓬勃的發(fā)展，主要依賴于高通量分離和分析技術(shù)的突破性進(jìn)步。首先是雙向凝膠電泳技術(shù)的完善，使得蛋白質(zhì)的大范圍、高通量分析成為可能。其次是質(zhì)譜技術(shù)尤其是軟電離技術(shù)的發(fā)展，使之成為檢測(cè)蛋白質(zhì)分子的重要手段。最后是生物信息學(xué)的建立使得國(guó)際性的科學(xué)大協(xié)作得以形成。目前，世界各主要國(guó)家都不惜巨資進(jìn)行蛋白質(zhì)組的研究。蛋白質(zhì)組學(xué)研究的進(jìn)一步深入，將對(duì)了解疾病的發(fā)生和藥物的篩選起到?jīng)Q定性的作用。 本論文工作包括兩個(gè)部分：第一部分為蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)平臺(tái)的建立與發(fā)展，建立了基于雙向電泳和質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)平臺(tái)，對(duì)膠內(nèi)酶解方法以及其濃縮方法進(jìn)行了改進(jìn)和發(fā)展，并對(duì)無(wú)機(jī)MALDI基質(zhì)作了初步研究。第二部分為疾病比較蛋白質(zhì)組初探，利用基于雙向電泳和生物質(zhì)譜的方法策略對(duì)缺血心肌線粒體以及高、低轉(zhuǎn)移潛能肝癌組織進(jìn)行了比較蛋白質(zhì)組分析。 第一部分 蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)平臺(tái)的建立與發(fā)展 聚丙烯酰胺凝膠電泳，包括一維和二維，是目前蛋白質(zhì)研究中用來(lái)分離復(fù)雜蛋白體系的最重要的手段。而對(duì)膠上蛋白進(jìn)行膠內(nèi)酶解以及質(zhì)譜分析，也已經(jīng)成為復(fù)雜體系中蛋白鑒定的最常用的方法。由于考馬斯亮藍(lán)的存在會(huì)影響酶解反應(yīng)，所有現(xiàn)有的膠內(nèi)酶解方法都要求在酶解反應(yīng)之前徹底除去凝膠中的考馬斯亮藍(lán)。這個(gè)過(guò)程增加了工作量，耗時(shí)而且會(huì)造成蛋白丟失，影響蛋白鑒定的靈敏度。本工作提出了一種簡(jiǎn)化的膠內(nèi)酶解方法，在酶解前不需除去考馬斯亮藍(lán)。利用簡(jiǎn) WP=7 化方法對(duì)500 ng BSA 進(jìn)行酶解，并用HPLC/ESIMS進(jìn)行分析。結(jié)果表明使用簡(jiǎn)化方法時(shí)酶解仍然可以有效進(jìn)行。另外，考馬斯亮藍(lán)在反相HPLC中有強(qiáng)保留，不會(huì)與肽段同時(shí)洗脫，所以不會(huì)對(duì)HPLC-ESIMS分析造成干擾。利用一系列不同上樣量的馬心肌紅蛋白對(duì)簡(jiǎn)化方法與傳統(tǒng)方法進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)簡(jiǎn)化方法傾向于產(chǎn)生更多的胰蛋白酶漏切位點(diǎn)，并可以因此提高序列覆蓋率。對(duì)簡(jiǎn)化方法在MALDI-TOFMS上的適用性進(jìn)行了驗(yàn)證，在用ZipTip脫鹽時(shí)使用33%的乙腈洗脫以防止考馬斯亮藍(lán)與肽段同時(shí)洗脫。50 ng BSA 可以得到令人滿意的結(jié)果，顯示了簡(jiǎn)化的方法可方便地用于MALDI-TOFMS檢測(cè)，并擁有足夠的靈敏度。用該方法對(duì)大鼠心肌線粒體蛋白雙向電泳圖上的兩個(gè)蛋白點(diǎn)進(jìn)行了成功鑒定，表明簡(jiǎn)化方法完全可以適用于實(shí)際生物樣品的分析。 在膠內(nèi)酶解產(chǎn)物的質(zhì)譜鑒定前，通常需對(duì)樣品進(jìn)行濃縮。常規(guī)的濃縮方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而且會(huì)由于容器表面吸附造成大量樣品損失。本論文發(fā)展了一種基于強(qiáng)陽(yáng)離子交換色譜(SCX)的凝膠內(nèi)酶切產(chǎn)物的在線預(yù)濃縮方法，可以方便地應(yīng)用于蛋白的LC-ESIMS分析。由于膠內(nèi)酶解肽段的提取液（5% FA或TFA/50%乙腈）恰好與SCX肽段吸附的條件相吻合，因此肽段提取液可以不經(jīng)過(guò)任何處理直接用SCX 柱濃縮，然后用1 M 醋酸銨溶液將吸附的肽段洗脫進(jìn)入反相LC-MS系統(tǒng)進(jìn)行分析。獨(dú)特設(shè)計(jì)的預(yù)濃縮/分析體系利用兩個(gè)六通閥將SCX和反相色譜相連，可以很方便地實(shí)現(xiàn)30倍的在線預(yù)濃縮。利用100 ng 的膠內(nèi)牛血清蛋白對(duì)該方法進(jìn)行了驗(yàn)證，與傳統(tǒng)的濃縮方法相比，該方法可以獲得9個(gè)肽段，而傳統(tǒng)的冷凍抽干方法僅得到5個(gè)。其原因有兩點(diǎn)：（1）新方法可以大大減少傳統(tǒng)方法的樣品干燥和轉(zhuǎn)移過(guò)程中由于容器表面吸附引起的損失。（2）在SCX濃縮過(guò)程中，可以除去樣品中的非離子性雜質(zhì)，有利于改善樣品峰的信噪比。另外，該方法具有省時(shí)、裝置簡(jiǎn)單、易于自動(dòng)化和有利于反相色譜柱的保護(hù)等優(yōu)點(diǎn)。 有機(jī)基質(zhì)的出現(xiàn)大大推動(dòng)了基質(zhì)輔助激光解析電離質(zhì)譜（MALDI-MS）在生物大分子分析中的應(yīng)用。然而有機(jī)基質(zhì)自身電離會(huì)在質(zhì)譜的低質(zhì)量范圍產(chǎn)生背景，影響MALDI-MS對(duì)小分子的分析。雖然有人研究了利用無(wú)機(jī)材料作為MALDI基質(zhì)的可能性，但其靈敏度非常低。本論文研究了一系列無(wú)機(jī)介孔材料（TiO2, CeTiO, ZrTiO, TiSiO, ZrO2, AlTiO, AlSiO和SiO2）作為MALDI基質(zhì)的可能性。樣品為PPG（分子量范圍500 至3000 Da）和一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)肽（分子量980 Da）。被測(cè)材料對(duì)分析物的電離能力表現(xiàn)出極大差異，TiO2 和CeTiO 靈敏度最高，ZrTiO, TiSiO, ZrO2, AlTiO 和AlSiO 的電離能力低得多，而SiO2無(wú)法使樣品電離。其該結(jié)果提示材料的靈敏度與UV吸收正相關(guān)。被分析物通常以鉀離子加合物的形式電離，偶見(jiàn)鈉離子加合
【圖文】：

Fig. 4 UV absorption of different materials從我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，材料的紫外強(qiáng)吸收是其能夠作為 MALDI 基質(zhì)的必要條件。圖 4 是各種材料的紫外吸收光譜。從圖 4 可看到，各種材料在 337 nm 處的紫外吸收強(qiáng)度從大到小依次為CeTiO, TiO2, TiPO, ZrO2, AlTiO, TiZrO, TiSiO。該次序與圖 1 中各材料對(duì)應(yīng)的質(zhì)譜圖強(qiáng)度基本一致。樣品的質(zhì)譜峰強(qiáng)度似與基質(zhì)的紫外吸收能力正相關(guān)。從目前廣泛認(rèn)可的 MALDI 機(jī)理來(lái)說(shuō)，這種結(jié)果也是合乎情理的。因?yàn)榛|(zhì)首先必須要吸收激光的能量才有可能將能量轉(zhuǎn)移至樣品以使其離子化。這也提示我們可以用材料的紫外吸收性質(zhì)來(lái)進(jìn)行無(wú)機(jī)基質(zhì)篩選。值得注意的是無(wú)紫外吸收的 SiO2在本實(shí)驗(yàn)中未得到任何信號(hào)，這與一部分文獻(xiàn)報(bào)道[12]吻合而與另一些文獻(xiàn)[13，14]相左，其原因可能是某些文獻(xiàn)中所使用的材料純度不夠高。3.3 CeTiO 基質(zhì)的耐鹽性
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2003
【分類號(hào)】：R341;O657.63

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本文編號(hào)：2592217