【摘要】： 杜氏藻包括鹽生杜氏藻(Dunaliella salina)及Dunaliella bardawil等，屬于自養(yǎng)的耐鹽單細(xì)胞真核綠藻，細(xì)胞形狀呈梨形，具雙鞭毛，胞內(nèi)有一個(gè)大的杯狀葉綠體。鹽藻可在0.05～5.0 mol／L(飽和度)的氯化鈉溶液中生長(zhǎng)繁殖，鹽藻細(xì)胞無(wú)細(xì)胞壁，其營(yíng)養(yǎng)體細(xì)胞屬于單倍體細(xì)胞。由于這些生物學(xué)特性，鹽藻是一個(gè)非常理想的生物反應(yīng)器候選宿主。此外，鹽藻是光合自養(yǎng)生物，所以它的培養(yǎng)只需簡(jiǎn)單的無(wú)機(jī)培養(yǎng)基，而模式生物如大腸桿菌、酵母等則需要富含有機(jī)物的培養(yǎng)基；鹽藻耐高濃度的氯化鈉，故鹽藻培養(yǎng)過(guò)程中不容易污染其它微生物；鹽藻無(wú)細(xì)胞壁，載體DNA等容易導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，故其轉(zhuǎn)化等遺傳操作較普通的植物細(xì)胞容易；鹽藻是真核生物，細(xì)胞內(nèi)存在蛋白質(zhì)的糖基化等翻譯后加工、修飾過(guò)程，故利用鹽藻生產(chǎn)的基因工程產(chǎn)物如蛋白質(zhì)或多肽藥物等，較之大腸桿菌等生產(chǎn)的基因工程產(chǎn)物更接近真核蛋白。另外，從轉(zhuǎn)基因的角度考慮，由于鹽藻營(yíng)養(yǎng)體細(xì)胞的基因組是單倍體，不存在雙倍體或多倍體細(xì)胞的基因型到表型的顯性、隱性等遺傳關(guān)系，所以其基因型能直接體現(xiàn)在表型上，非常有利于遺傳突變株的篩選。目前國(guó)內(nèi)外報(bào)道較多的對(duì)鹽藻的研究主要仍集中在胡蘿卜素的生產(chǎn)和利用以及鹽藻的耐鹽機(jī)理上，但對(duì)鹽藻進(jìn)行轉(zhuǎn)基因研究，在國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)到報(bào)道。 鹽藻Dunaliella bardawil屬于杜氏藻的一種，它較之鹽生杜氏藻 鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院2003年博士論文 光誘導(dǎo)表達(dá)載體的構(gòu)建及其在鹽藻除草劑抗性轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用 (Dunaliella salina)具有更強(qiáng)的胡蘿卜素合成能力，胡蘿卜素含量占其 干重可達(dá)10%I8]。Dunaliellaba炸lawil中的cbr基因是一種與胡蘿卜素 生物合成相關(guān)的基因，cb:的表達(dá)與高等植物的早期光誘導(dǎo)基因(e arly light一induced genes，e一ip)的表達(dá)密切相關(guān)[81，eBR蛋白后被認(rèn)為是一種 玉米黃質(zhì)結(jié)合蛋白，后者與CBR蛋白結(jié)合后形成的復(fù)合物對(duì)鹽藻的光 合作用系統(tǒng)起一種保護(hù)作用I9]，cBR基因是一種誘導(dǎo)表達(dá)的基因，誘 導(dǎo)條件包括強(qiáng)光、硫酸鹽剝奪以及norflurazon(一種除草劑)處理等[0]。 業(yè)已證明，野生鹽藻對(duì)許多抗生素具有抗性[10，1‘];雖然鹽藻對(duì)氯 霉素敏感，但根據(jù)我們實(shí)驗(yàn)室過(guò)去研究經(jīng)驗(yàn)，用氯霉素抗性來(lái)篩選轉(zhuǎn) 化的鹽藻，現(xiàn)象不明顯，篩選周期長(zhǎng);而后來(lái)我們自己的研究表明， 野生的鹽藻，無(wú)論是Dunalzella:alina[‘2]還是Dunaliella ba凡lawil(數(shù) 據(jù)未顯)，均對(duì)除草劑草T磷(phosphinothricin，即T)敏感。最低3 .omg幾 劑量的草丁嶙就能夠完全抑制鹽藻的生長(zhǎng)。草丁嶙系谷氨酸的結(jié)構(gòu)類 似物，進(jìn)入細(xì)胞后可以抑制谷氨酞胺合成酶從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)積累高濃 度的氨而使細(xì)胞發(fā)生氨中毒【‘’〕。Bar基因是除草劑抗性基因，其編碼產(chǎn) 物草丁嶙乙酞轉(zhuǎn)移酶可以使PPT乙酞化而失去毒性[l4，”]。 本實(shí)驗(yàn)室實(shí)踐證明，對(duì)鹽藻使用除草劑草丁嶙篩選體系，效果明 顯。 為對(duì)鹽藻進(jìn)行轉(zhuǎn)基因研究，我們?cè)O(shè)計(jì)并克隆了一種光誘導(dǎo)的鹽藻 表達(dá)載體，用于鹽藻的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化和穩(wěn)定轉(zhuǎn)化。在該載體中我們將外源的 bar基因插入到Dunal心la ba尹’c lawil的CBR基因的啟動(dòng)子(強(qiáng)光誘導(dǎo)表 達(dá))之下，并在bar基因下游接上CBR基因的終止子(3，一UTR，， 3‘一tintranslated region)，構(gòu)成一個(gè)bar基因的表達(dá)盒。 作者在鹽藻的培養(yǎng)等生物學(xué)特性的研究基礎(chǔ)上，建立了兩種鹽藻轉(zhuǎn) 化方法，即電激轉(zhuǎn)染和磷酸鈣共沉淀轉(zhuǎn)染。利用自己構(gòu)建的鹽藻光誘導(dǎo) 載體，分別通過(guò)電激轉(zhuǎn)染和磷酸鈣共沉淀轉(zhuǎn)染，進(jìn)行鹽藻的除草劑抗性 鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院2003年博士論文 光誘導(dǎo)表達(dá)載體的構(gòu)建及其在鹽藻除草劑抗性轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用 轉(zhuǎn)化，從細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)的角度對(duì)兩種轉(zhuǎn)化方法進(jìn)行了比較和 分析，為轉(zhuǎn)基因鹽藻生物反應(yīng)器研究初步建立了兩種比較穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化方 法。 本研究論文分兩部分，第一部分闡述鹽藻光誘導(dǎo)表達(dá)載體pPB3RZa 的分子克隆過(guò)程;第二部分闡述對(duì)鹽藻基本生物學(xué)特性的研究和用載體 pPB3RZa轉(zhuǎn)化野生鹽藻Dunaliella bardawil賦予其除草劑抗性以及對(duì) Dunaliella.Bardawil轉(zhuǎn)基因方面的研究工作，包括轉(zhuǎn)基因的檢測(cè)等。 1.方法 鹽藻光誘導(dǎo)表達(dá)載體pPB3RZa的構(gòu)建 鹽藻Dunaliella ba程lawil的。br基因啟動(dòng)子區(qū)片段的PCR擴(kuò)增 首先提取鹽藻Dunal招l(wèi)la baz農(nóng)匕wil的基因組DNA，根據(jù)cbr基因序 列，通過(guò)計(jì)算機(jī)引物設(shè)計(jì)程序Primer Premier，設(shè)計(jì)巢式PCR兩對(duì)引物， 外側(cè)上游弓}物cbrsws:s‘GGeGGeGGAGAAAGGGAoAAGAA以G3‘，外 側(cè)下游引物:cbrswx，5‘AGAG“GeGGGAeGA魷燈TGAIGGA3’;一 對(duì)內(nèi)側(cè)上游引物的5’端具限制序列及保護(hù)序列，上游引物為cbrsns， 5‘CGGG工皿工叢晝鑫CCCCATTCGTCeT以TTeTGGeTeT3‘(Xbal)，下游引物 為cbrsnx，5‘月A旦燮里里G門℃戌rc汀CC月厭汀GCAfCGU哎汀衛(wèi)岌孫‘(EeoRx)。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)分兩步進(jìn)行，第一輪反應(yīng)應(yīng)用上述1對(duì)外側(cè)引物和自己研究的 一種改良的降落PCR程序，以提取的Dunaliella ba矛農(nóng)云wil基因組DNA 為模板，進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。巢式PCR第二輪反應(yīng)以第一輪反應(yīng)的產(chǎn)物為 模板，使用上述一對(duì)內(nèi)側(cè)引物，通過(guò)普通PCR程序進(jìn)行
【圖文】：

llMEPX32lM圖13ppB3L的xbal和EeoRI酶切鑒定ker;E:EeoRI;P:未切的質(zhì)粒;X:Xbal;后，產(chǎn)生1.7kb和3.3kb兩片段，這是因(約0.6kb)下游分別各有一Xbal未被EcoRI切開(kāi)，、提示其中的EcoRI結(jié)果照附錄二分序列:GTTCAC戶J，TCGCACTCAAAGCTCCATTCTCGGCCACAAGTTTGCCACCCTCGAAAAC毛勺勺紅’ACTATCCAAACACT

才有可能在最終載體用Xbal和Sacl雙酶切得到線性的bar基因表達(dá)盒。要消除這個(gè)多克隆位點(diǎn)，可以用限制酶BamHI和Hindlll雙酶切質(zhì)粒PPB3L，然后再用T4DNA聚合酶補(bǔ)平，最后用T4DNA連接酶連接起來(lái)(自身環(huán)化)。圖14顯示連接后幾種質(zhì)粒的Xbal酶切鑒定結(jié)果。
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2003
【分類號(hào)】：Q78

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本文編號(hào)：2591515