【摘要】：葡激酶(Staphylokinase,Sak)是由某些金黃色葡萄球菌產(chǎn)生的具有活化纖溶酶原作用的蛋白質(zhì)。Sak與纖溶酶原結(jié)合,形成1:1的復合物,發(fā)揮激活纖溶酶原的作用。Sak具有纖維蛋白特異性高,不激活系統(tǒng)性纖溶,無出血危險;溶栓效果好,對富含血小板的動脈血栓效果尤為突出;分子量小,穿透性能好等優(yōu)點,因而成為一種具有良好應用前景的溶栓藥物。但Sak存在有免疫原性、循環(huán)半衰期短等缺點,本研究期望能通過提高Sak活性從一定程度上緩解這些矛盾。 近年來發(fā)展起來的體外定向進化技術(shù),可以在未知目標蛋白三維結(jié)構(gòu)信息和作用機制的情況下,通過對編碼基因的隨機突變、重組和定向篩選,獲得具有改進功能或全新功能的蛋白質(zhì)。該技術(shù)可用于任何有合適篩選或選擇方法的蛋白質(zhì)的改造,是改造治療性蛋白質(zhì)的強有力手段。本研究運用體外定向進化的方法對野生型Sak進行改造,探索簡便、有效、優(yōu)化的Sak體外定向進化的技術(shù)路線,篩選活性增高的Sak突變體。 首先,本研究采用易錯PCR法對野生型sak基因進行隨機誘變,建立隨機突變庫,篩選活性提高的突變體。在反應體系中添加Mn~(2+),提高Mg~(2+)濃度至3mmol/L,使用不平衡的各種dNTP:0.2mmol/L dATP和dGTP,1mmol/L dCTP和dTTP,通過調(diào)整Mn~(2+)的濃度(0.05、0.1、0.15、0.2、0.3、0.4、0.5mmol/L)來調(diào)節(jié)突變率,隨機抽樣測序的結(jié)果表明,Mn~(2+)的濃度為0.15mmol/L時突變率為0.56%,活性克隆約占70%。用血漿瓊脂平板法篩選出大約10000個活性克隆,其中挑選出100個溶圈較大的克隆作為潛在高活力克隆,用纖維蛋白瓊脂平板打孔法重復篩選。獲得活性為野生型Sak2倍的突變株2株,1.5倍的突變株1株。 以三株良性突變體的基因為親本進行DNA改組,建立改組文庫,用血漿瓊脂平板法篩選,活性克隆約占70%,篩選到大約10000個活性克隆,從中挑選出100個溶圈較大的克隆作為潛在高活力克隆,用纖維蛋白瓊脂平板打孔法進行重復篩選,未篩選到活性進一步提高的克隆。從100個克隆中隨機挑選了10個克隆進行測序,隨機突變頻率為0.35%,其中兩個突變子發(fā)生不同親本之間的重組。 用交錯延伸技術(shù)對三株良性突變體的基因進行重組,建立重組文庫,用血漿瓊脂平板法篩選,活性克隆約占90%,篩選到大約10000個活性克隆,從中挑
【學位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2004
【分類號】：R346

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前4條

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本文編號：2591024