【摘要】： 目的:通過(guò)細(xì)胞模型和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型,研究沙門菌毒力基因(Salmonella plasmid virulence genes,spv)對(duì)樹(shù)突狀細(xì)胞(dendritic cells,DCs)自噬、凋亡和免疫調(diào)節(jié)功能的影響及其分子機(jī)制,探索通過(guò)調(diào)控細(xì)胞自噬和凋亡水平增強(qiáng)機(jī)體免疫功能以控制感染進(jìn)程的新途徑,并為后續(xù)新藥靶位的發(fā)現(xiàn)提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法: 1.細(xì)胞模型的體外實(shí)驗(yàn)。以攜帶spv基因的傷寒沙門菌(Salmonella typhi,ST)ST8為研究對(duì)象,用含spv基因的鼠傷寒沙門菌標(biāo)準(zhǔn)毒株SR-11作為陽(yáng)性對(duì)照、不攜帶spv基因的傷寒沙門菌ST10作為陰性對(duì)照,將細(xì)菌與小鼠骨髓來(lái)源的DCs(bone marrow-derived DCs,BMDCs)共培養(yǎng);同時(shí)用不加細(xì)菌的正常細(xì)胞作對(duì)照組;另設(shè)自噬激動(dòng)劑雷帕霉素(rapamycin,RAPA)干預(yù)組,即將細(xì)胞預(yù)先用含RAPA的培養(yǎng)基過(guò)夜處理后分別與上述三種細(xì)菌共培養(yǎng)。分別于不同時(shí)間段收獲細(xì)胞,用Western blot法檢測(cè)BMDCs自噬蛋白Beclin-1的表達(dá),比色法測(cè)定其Caspase-3的活性,流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry,FCM)分析BMDCs的凋亡率、吞噬能力以及表面共刺激分子CD40、CD80和CD86的表達(dá),混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(mixed lymphocyte reaction,MLR)檢測(cè)BMDCs刺激CD4+和CD8+初始型T(naive T)細(xì)胞增殖的能力,ELISA法測(cè)定培養(yǎng)液上清中IL-12、IFN-γ、IL-10和IL-4等細(xì)胞因子的水平,臺(tái)盼藍(lán)染色法進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù),平板菌落計(jì)數(shù)法檢測(cè)BMDCs內(nèi)活菌數(shù)。 2.小鼠模型的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。由于傷寒沙門菌是一種嚴(yán)格只對(duì)人類致病的病原體,沒(méi)有合適的動(dòng)物模型和有效的遺傳學(xué)工具,本實(shí)驗(yàn)利用與其有非常近緣關(guān)系的鼠傷寒沙門菌建立動(dòng)物感染模型,用鼠傷寒沙門菌標(biāo)準(zhǔn)毒株SR-11和不攜帶spv基因的低毒株BRD509經(jīng)腹腔注射感染小鼠;同時(shí)以未感染細(xì)菌的小鼠作為正常對(duì)照組;另設(shè)RAPA干預(yù)組,即在感染模型建立后每天經(jīng)腹腔注射適量RAPA。分別在不同時(shí)間段觀察小鼠一般狀態(tài),處死小鼠后比較肝臟和脾臟的病理變化,免疫組化法檢測(cè)肝臟和脾臟Beclin-1和Caspase-3蛋白的表達(dá),FCM分析脾臟DCs的凋亡率、吞噬能力及表面共刺激分子CD40、CD80和CD86的表達(dá),MLR檢測(cè)脾臟DCs刺激naive T細(xì)胞增殖的能力,ELISA法測(cè)定血清中IL-12、IFN-γ、IL-10和IL-4等細(xì)胞因子的水平,平板菌落計(jì)數(shù)法檢測(cè)小鼠肝臟和脾臟的活菌數(shù)。 結(jié)果: 1.用RAPA干預(yù)前,細(xì)菌與BMDCs共作用后2 h,ST10組的Beclin-1表達(dá)量高于SR-11組和ST8組,RAPA干預(yù)后0 h即可出現(xiàn)此差異;體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示細(xì)菌感染早期,BRD509組小鼠臟器的Beclin-1表達(dá)高于SR-11組。用RAPA干預(yù)后體內(nèi)外各組Beclin-1的表達(dá)均升高。 2.用RAPA干預(yù)前,體內(nèi)外各組DCs的凋亡率和Caspase-3活性均隨感染時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸升高。體外實(shí)驗(yàn)SR-11組和ST8組高于ST10組,用RAPA干預(yù)后,SR-11組和ST8組下降,而ST10組上升;體內(nèi)小鼠脾臟DCs的凋亡率和Caspase-3活性表現(xiàn)為SR-11組高于BRD509組,用藥后SR-11組降低,而B(niǎo)RD509組升高。 3.用RAPA干預(yù)前,隨感染時(shí)間的延長(zhǎng),體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)各組DCs的吞噬能力均不斷下降。體外實(shí)驗(yàn)ST10組的吞噬率低于SR-11組和ST8組;體內(nèi)實(shí)驗(yàn)BRD509組的吞噬率低于SR-11組。用RAPA干預(yù)后,體內(nèi)外各組DCs的吞噬率均明顯下降。 4.用RAPA干預(yù)前,體內(nèi)外各組DCs表面共刺激分子CD40、CD80和CD86的表達(dá)均隨感染時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸升高,刺激naive T細(xì)胞增殖的能力也不斷增強(qiáng)。體外實(shí)驗(yàn)顯示ST10組明顯強(qiáng)于SR-11組和ST8組;體內(nèi)實(shí)驗(yàn)BRD509組明顯強(qiáng)于SR-11組。用RAPA干預(yù)后,體內(nèi)外各組DCs共刺激分子的表達(dá)均上升,naive T細(xì)胞的增殖程度亦升高。 5.用RAPA干預(yù)前,體內(nèi)外各組IL-12和IFN-γ水平隨著時(shí)間延長(zhǎng)顯著升高。體外表現(xiàn)為ST10組明顯高于SR-11組和ST8組;體內(nèi)實(shí)驗(yàn)BRD509組明顯高于SR-11組。用RAPA干預(yù)后,體內(nèi)外各組IL-12和IFN-γ的水平均上升。 6.用RAPA干預(yù)前,體內(nèi)外各組在細(xì)菌感染早期均未檢測(cè)到IL-10。體外感染后期SR-11組和ST8組BMDCs分泌的IL-10大量增加,明顯高于ST10組;體內(nèi)感染后期SR-11組的IL-10有表達(dá),而B(niǎo)RD509則仍檢測(cè)不到。用RAPA干預(yù)后,體內(nèi)外各組IL-10的表達(dá)水平均低于用藥前。不管RAPA干預(yù)與否,各組均未檢測(cè)到IL-4的表達(dá)。 7.用RAPA干預(yù)前,體外實(shí)驗(yàn)SR-11組和ST8組BMDCs的存活率低于ST10組,而胞內(nèi)活菌數(shù)則SR-11組和ST8組高于ST10;體內(nèi)感染后期,SR-11組小鼠的一般狀態(tài)較BRD509組差,臟器病理變化嚴(yán)重,活菌數(shù)亦較高。用RAPA干預(yù)后,體外實(shí)驗(yàn)SR-11組和ST8組BMDCs的存活率升高,而ST10組降低,胞內(nèi)活菌數(shù)表現(xiàn)為SR-11組和ST8組降低,而ST10組升高;體內(nèi)實(shí)驗(yàn)SR-11組臟器內(nèi)活菌數(shù)降低而B(niǎo)RD509組升高,SR-11組臟器較用藥前損傷減輕而B(niǎo)RD509組加重。 結(jié)論: 1.攜帶spv基因的沙門菌由于毒力較強(qiáng),可通過(guò)抑制自噬,促進(jìn)凋亡而加重感染,用RAPA干預(yù)其體內(nèi)外感染模型后自噬被適度激活可對(duì)細(xì)胞和機(jī)體起到一定的保護(hù)作用;而無(wú)spv基因的沙門菌可通過(guò)適度激活自噬以減少細(xì)菌對(duì)細(xì)胞和機(jī)體的損害,對(duì)自身起到保護(hù)作用,當(dāng)自噬被RAPA過(guò)度增強(qiáng)后,反而導(dǎo)致宿主的損傷。 2.攜帶spv基因的沙門菌能抑制小鼠DCs的成熟,使之刺激naive T細(xì)胞增殖的能力下降;RAPA可促進(jìn)DCs的成熟,增強(qiáng)其抗原提呈能力。 3.沙門菌感染后刺激小鼠DCs誘導(dǎo)產(chǎn)生以Th1優(yōu)勢(shì)應(yīng)答為主的免疫反應(yīng),機(jī)體產(chǎn)生的適度免疫應(yīng)答能有效地清除低毒株的感染,而攜帶spv基因的沙門菌毒力株能抵抗和逃逸宿主的免疫防御。RAPA可通過(guò)增強(qiáng)自噬促進(jìn)Th1類細(xì)胞因子的分泌并抑制Th2類免疫應(yīng)答從而發(fā)揮抗胞內(nèi)菌感染的作用。
【圖文】：

0.20.250.30.35ivity(DO045)☆Δ☆Δ#**圖 1-1 Western Blot 檢測(cè) Beclin-1 蛋白的表達(dá)Figure 1-1. Beclin-1 expression of BMDCs detected by Western Blot1, 4: SR-11 group; 2, 5: ST8 group; 3, 6: ST10 group; 7, 10: SR-11+RAPA group;8, 11: ST8+RAPA group; 9, 12: ST10+RAPA group; 13: Control group2.2 Caspase-3 活性的檢測(cè)用 RAPA 干預(yù)前，各組 BMDCs Caspase-3 的活性在 12 h 均表現(xiàn)為 SR-11 組㧐ST8 組㧐ST10 組，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P㩳0.05），，24 h 時(shí)各組活性持續(xù)升高，組間差異更加明顯（P㩳0.05）。用 RAPA 干預(yù)后，SR-11 組和 ST8 組細(xì)胞的Caspase-3 活性明顯降低，而 ST10 組則升高（P㩳0.05）（圖 1-2）。

34圖 2-2 小鼠肝臟的病理改變（HE; 40×）The pathological change of mice liver detectedControl
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R392

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前6條

1 ;Molecular Analysis and Identification of Virulence Gene on pR_(ST98) from Multi-Drug Resistant Salmonella typhi[J];Cellular & Molecular Immunology;2005年02期

2 吳淑燕;李瓊;儲(chǔ)元元;李Z腦

本文編號(hào)：2587254