發(fā)布時間：2020-03-15 19:47

【摘要】： 目的:通過細胞模型和實驗動物模型,研究沙門菌毒力基因(Salmonella plasmid virulence genes,spv)對樹突狀細胞(dendritic cells,DCs)自噬、凋亡和免疫調節(jié)功能的影響及其分子機制,探索通過調控細胞自噬和凋亡水平增強機體免疫功能以控制感染進程的新途徑,并為后續(xù)新藥靶位的發(fā)現(xiàn)提供理論和實驗依據。 方法: 1.細胞模型的體外實驗。以攜帶spv基因的傷寒沙門菌(Salmonella typhi,ST)ST8為研究對象,用含spv基因的鼠傷寒沙門菌標準毒株SR-11作為陽性對照、不攜帶spv基因的傷寒沙門菌ST10作為陰性對照,將細菌與小鼠骨髓來源的DCs(bone marrow-derived DCs,BMDCs)共培養(yǎng);同時用不加細菌的正常細胞作對照組;另設自噬激動劑雷帕霉素(rapamycin,RAPA)干預組,即將細胞預先用含RAPA的培養(yǎng)基過夜處理后分別與上述三種細菌共培養(yǎng)。分別于不同時間段收獲細胞,用Western blot法檢測BMDCs自噬蛋白Beclin-1的表達,比色法測定其Caspase-3的活性,流式細胞術(flow cytometry,FCM)分析BMDCs的凋亡率、吞噬能力以及表面共刺激分子CD40、CD80和CD86的表達,混合淋巴細胞反應(mixed lymphocyte reaction,MLR)檢測BMDCs刺激CD4+和CD8+初始型T(naive T)細胞增殖的能力,ELISA法測定培養(yǎng)液上清中IL-12、IFN-γ、IL-10和IL-4等細胞因子的水平,臺盼藍染色法進行活細胞計數(shù),平板菌落計數(shù)法檢測BMDCs內活菌數(shù)。 2.小鼠模型的體內實驗。由于傷寒沙門菌是一種嚴格只對人類致病的病原體,沒有合適的動物模型和有效的遺傳學工具,本實驗利用與其有非常近緣關系的鼠傷寒沙門菌建立動物感染模型,用鼠傷寒沙門菌標準毒株SR-11和不攜帶spv基因的低毒株BRD509經腹腔注射感染小鼠;同時以未感染細菌的小鼠作為正常對照組;另設RAPA干預組,即在感染模型建立后每天經腹腔注射適量RAPA。分別在不同時間段觀察小鼠一般狀態(tài),處死小鼠后比較肝臟和脾臟的病理變化,免疫組化法檢測肝臟和脾臟Beclin-1和Caspase-3蛋白的表達,FCM分析脾臟DCs的凋亡率、吞噬能力及表面共刺激分子CD40、CD80和CD86的表達,MLR檢測脾臟DCs刺激naive T細胞增殖的能力,ELISA法測定血清中IL-12、IFN-γ、IL-10和IL-4等細胞因子的水平,平板菌落計數(shù)法檢測小鼠肝臟和脾臟的活菌數(shù)。 結果: 1.用RAPA干預前,細菌與BMDCs共作用后2 h,ST10組的Beclin-1表達量高于SR-11組和ST8組,RAPA干預后0 h即可出現(xiàn)此差異;體內實驗顯示細菌感染早期,BRD509組小鼠臟器的Beclin-1表達高于SR-11組。用RAPA干預后體內外各組Beclin-1的表達均升高。 2.用RAPA干預前,體內外各組DCs的凋亡率和Caspase-3活性均隨感染時間的延長逐漸升高。體外實驗SR-11組和ST8組高于ST10組,用RAPA干預后,SR-11組和ST8組下降,而ST10組上升;體內小鼠脾臟DCs的凋亡率和Caspase-3活性表現(xiàn)為SR-11組高于BRD509組,用藥后SR-11組降低,而BRD509組升高。 3.用RAPA干預前,隨感染時間的延長,體內外實驗各組DCs的吞噬能力均不斷下降。體外實驗ST10組的吞噬率低于SR-11組和ST8組;體內實驗BRD509組的吞噬率低于SR-11組。用RAPA干預后,體內外各組DCs的吞噬率均明顯下降。 4.用RAPA干預前,體內外各組DCs表面共刺激分子CD40、CD80和CD86的表達均隨感染時間的延長逐漸升高,刺激naive T細胞增殖的能力也不斷增強。體外實驗顯示ST10組明顯強于SR-11組和ST8組;體內實驗BRD509組明顯強于SR-11組。用RAPA干預后,體內外各組DCs共刺激分子的表達均上升,naive T細胞的增殖程度亦升高。 5.用RAPA干預前,體內外各組IL-12和IFN-γ水平隨著時間延長顯著升高。體外表現(xiàn)為ST10組明顯高于SR-11組和ST8組;體內實驗BRD509組明顯高于SR-11組。用RAPA干預后,體內外各組IL-12和IFN-γ的水平均上升。 6.用RAPA干預前,體內外各組在細菌感染早期均未檢測到IL-10。體外感染后期SR-11組和ST8組BMDCs分泌的IL-10大量增加,明顯高于ST10組;體內感染后期SR-11組的IL-10有表達,而BRD509則仍檢測不到。用RAPA干預后,體內外各組IL-10的表達水平均低于用藥前。不管RAPA干預與否,各組均未檢測到IL-4的表達。 7.用RAPA干預前,體外實驗SR-11組和ST8組BMDCs的存活率低于ST10組,而胞內活菌數(shù)則SR-11組和ST8組高于ST10;體內感染后期,SR-11組小鼠的一般狀態(tài)較BRD509組差,臟器病理變化嚴重,活菌數(shù)亦較高。用RAPA干預后,體外實驗SR-11組和ST8組BMDCs的存活率升高,而ST10組降低,胞內活菌數(shù)表現(xiàn)為SR-11組和ST8組降低,而ST10組升高;體內實驗SR-11組臟器內活菌數(shù)降低而BRD509組升高,SR-11組臟器較用藥前損傷減輕而BRD509組加重。 結論: 1.攜帶spv基因的沙門菌由于毒力較強,可通過抑制自噬,促進凋亡而加重感染,用RAPA干預其體內外感染模型后自噬被適度激活可對細胞和機體起到一定的保護作用;而無spv基因的沙門菌可通過適度激活自噬以減少細菌對細胞和機體的損害,對自身起到保護作用,當自噬被RAPA過度增強后,反而導致宿主的損傷。 2.攜帶spv基因的沙門菌能抑制小鼠DCs的成熟,使之刺激naive T細胞增殖的能力下降;RAPA可促進DCs的成熟,增強其抗原提呈能力。 3.沙門菌感染后刺激小鼠DCs誘導產生以Th1優(yōu)勢應答為主的免疫反應,機體產生的適度免疫應答能有效地清除低毒株的感染,而攜帶spv基因的沙門菌毒力株能抵抗和逃逸宿主的免疫防御。RAPA可通過增強自噬促進Th1類細胞因子的分泌并抑制Th2類免疫應答從而發(fā)揮抗胞內菌感染的作用。
【圖文】：

0.20.250.30.35ivity(DO045)☆Δ☆Δ#**圖 1-1 Western Blot 檢測 Beclin-1 蛋白的表達Figure 1-1. Beclin-1 expression of BMDCs detected by Western Blot1, 4: SR-11 group; 2, 5: ST8 group; 3, 6: ST10 group; 7, 10: SR-11+RAPA group;8, 11: ST8+RAPA group; 9, 12: ST10+RAPA group; 13: Control group2.2 Caspase-3 活性的檢測用 RAPA 干預前，各組 BMDCs Caspase-3 的活性在 12 h 均表現(xiàn)為 SR-11 組㧐ST8 組㧐ST10 組，組間差異具有統(tǒng)計學意義（P㩳0.05），，24 h 時各組活性持續(xù)升高，組間差異更加明顯（P㩳0.05）。用 RAPA 干預后，SR-11 組和 ST8 組細胞的Caspase-3 活性明顯降低，而 ST10 組則升高（P㩳0.05）（圖 1-2）。

34圖 2-2 小鼠肝臟的病理改變（HE; 40×）The pathological change of mice liver detectedControl
【學位授予單位】：蘇州大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R392

【參考文獻】

相關期刊論文 前6條

1 ;Molecular Analysis and Identification of Virulence Gene on pR_(ST98) from Multi-Drug Resistant Salmonella typhi[J];Cellular & Molecular Immunology;2005年02期

2 吳淑燕;李瓊;儲元元;李Z腦

本文編號：2587254