【摘要】： 目的:利用原子力顯微鏡(AFM)研究粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)誘導(dǎo)培養(yǎng)的骨髓源性未成熟與成熟樹突狀細(xì)胞(DC)的超微結(jié)構(gòu)及其細(xì)胞膜的機(jī)械性質(zhì)。方法:建立GM-CSF體外誘導(dǎo)培養(yǎng)小鼠骨髓來源DC的模型,并聯(lián)合運(yùn)用光學(xué)顯微鏡和AFM觀察骨髓細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化。通過免疫磁珠法分選CD11c陽性的DC,并將分選得到的DC分為對照組、Jagged-1組和LPS組。運(yùn)用熒光標(biāo)記單克隆抗體染色技術(shù)結(jié)合流式細(xì)胞儀檢測各組DC成熟的表面標(biāo)記MHCⅡ的表達(dá)水平,以及ELISA方法檢測DC上清液中IL-12的表達(dá)水平。聯(lián)合運(yùn)用SEM和AFM觀察未成熟和成熟DC的超微結(jié)構(gòu),并通過AFM檢測未成熟和成熟DC的細(xì)胞大小及其細(xì)胞膜的粗糙度與粘附力大小。結(jié)果:第6天,GM-CSF誘導(dǎo)培養(yǎng)的骨髓細(xì)胞具有明顯分化現(xiàn)象,主要是聚集成團(tuán)的圓形或橢圓形半貼壁細(xì)胞和分散的長梭形貼壁細(xì)胞組成。LPS組中MHCⅡ陽性的細(xì)胞數(shù)量大幅增加,并且該組上清液中IL-12的含量顯著高于對照組和Jagged-1組,表明DC經(jīng)LPS刺激后獲得功能性成熟。SEM的掃描結(jié)果證實(shí),對照組和Jagged-1組的DC細(xì)胞比較小且細(xì)胞的突觸少而短,而LPS刺激組的DC細(xì)胞比較大且具有豐富的長的突觸,表明DC經(jīng)LPS刺激后獲得形態(tài)上的成熟。AFM對未成熟和成熟DC形態(tài)的觀察結(jié)果基本與SEM吻合,但AFM圖像中DC細(xì)胞膜的皺縮以及突觸的收縮比較不明顯,表明AFM技術(shù)對細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的破壞程度更小。AFM的數(shù)量化分析顯示,成熟DC在細(xì)胞膜的粗糙度和粘附作用方面均顯著大于未成熟DC。結(jié)論:比起SEM,AFM對細(xì)胞的損傷更小,可以觀察到更清晰和完整的細(xì)胞膜超微結(jié)構(gòu),是一種適合觀察類似DC這種具有突觸結(jié)構(gòu)的細(xì)胞技術(shù)。成熟DC細(xì)胞膜表面更加粗糙,而且粘附能力更強(qiáng),表明DC分化導(dǎo)致的細(xì)胞骨架重組對其細(xì)胞膜的超微結(jié)構(gòu)及表面機(jī)械性質(zhì)都具有較大影響,為DC成熟提供新的依據(jù)。
【圖文】：

2和4天添加GM一CSF來誘導(dǎo)骨髓細(xì)胞的分化。第6天，新分離的未經(jīng)GM一CSF誘導(dǎo)的骨髓細(xì)胞，呈較為規(guī)則的圓形或橢圓形形狀，生長處于均勻分散的狀態(tài)(圖la)而經(jīng)過GM一CSF誘導(dǎo)的骨髓細(xì)胞，有一部分仍然保持圓形或橢圓形形狀，并聚集團(tuán)生長，呈半貼壁狀態(tài);另一部分細(xì)胞則由原來的圓形分化成長梭形細(xì)胞，分散緊貼著培養(yǎng)板板底生長(圖lb)。進(jìn)一步，我們利用AFM觀察GM一CSF誘導(dǎo)后的單個(gè)骨髓細(xì)胞。結(jié)果顯示，聚集成團(tuán)的骨髓細(xì)胞呈現(xiàn)圓的、球形形狀，個(gè)頭比較小但比較高，直徑一般為14到20阿，高度可達(dá)3娜以上，細(xì)胞膜表面比較光滑且其邊緣只有少量短的突觸(圖ZA，B，a，al和a2);而分散生長的梭形細(xì)胞形狀既扁又長，長度可達(dá)40到60娜，但它們的高度基本在3腳以下，有的甚至不到腳，細(xì)胞膜表面比較粗糙且向細(xì)胞兩端擴(kuò)展伸長，，使其能牢牢貼著細(xì)胞培養(yǎng)板板底生長(圖ZC，D，b，bl和b2)。可見，GM一CSF誘導(dǎo)的骨髓細(xì)胞出現(xiàn)了明顯的分化現(xiàn)象。

一csF誘導(dǎo)后骨髓細(xì)胞的AFM單細(xì)胞圖像FMimagesofsingleGM一CSF一treatedBMC，D)HeightProfilesofroundandshuttle一likeGM一CSF一treatedBMC:(a，al，ultrastruetureobtainedforroundGM一CSF一treatedBMC，scannlngarea
【學(xué)位授予單位】：暨南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號】：R392

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本文編號：2582028