【摘要】： 摘要目的：研究大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(Rat mesenchymal stem cells, rMSCs)以及經(jīng)誘導分化為神經(jīng)元樣細胞后腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、神經(jīng)生長因子(NGF)、神經(jīng)營養(yǎng)素-3(NT3)、睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF)和膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)的表達情況。 方法：取Wistar大鼠骨髓,提取、分離、培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細胞,用免疫熒光染色及流式細胞儀行CD44、CD45和CD90鑒定。取傳第3代的骨髓間充質(zhì)干細胞用DMEM、0.1 mmol/L2-巰基乙醇和2%二甲基亞砜,預誘導5小時后更換含10%FBS的DMEM、10μg/L堿性成纖維細胞生長因子(FGF)、10μg/L表皮生長因子(EGF)共1ml,置入37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中誘導維持7天和14天,熒光相差顯微鏡觀察細胞形態(tài),行神經(jīng)元標志物Nestin、NF、MAP-2、β-tubulinⅢ、Chat和GFAP免疫熒光染色和流式細胞儀鑒定。分別在細胞傳1、3、5代及誘導7天和14天時采用RT-PCR及ELISA測定骨髓間充質(zhì)干細胞和神經(jīng)元樣細胞表達BDNF、NGF、NT3、CNTF和GDNF的情況。 結(jié)果：骨髓間充質(zhì)干細胞經(jīng)誘導后大約有80%的細胞呈神經(jīng)元樣改變,免疫熒光染色顯示神經(jīng)元標志物Nestin陽性率40.17%±2.95%、NF陽性率16.00%±1.23%、MAP-2陽性率36.30%±1.78%、tubulinβⅢ陽性率19.00%±1.58%、Chat陽性率19.30%±1.38%和GFAP陽性率39.17%±1.95%。RT-PCR顯示骨髓間充質(zhì)干細胞能夠表達BDNF、NGF、NT3、CNTF和GDNF;而ELISA分析證明在骨髓間充質(zhì)干細胞傳第3代時上述神經(jīng)營養(yǎng)因子處于高峰,CNTF表達量最高,比NT3高15倍；從傳第1代到第5代CNTF表達變化小于1倍,但是BDNF表達變化則多于8倍；分化為神經(jīng)元樣細胞后表達上述神經(jīng)營養(yǎng)因子的能力下降,特別是CNTF及BDNF下降至一半；在誘導7天時NGF、BDNF、GDNF表達略高于誘導14天,而CNTF、NT3的表達則比誘導14天時稍減少。 結(jié)論：1.骨髓間充質(zhì)干細胞能夠表達BDNG, NGF, CNTF, GDNF和NT3,且在細胞傳第三代時處于高峰,以CNTF的表達量最高。2.骨髓間充質(zhì)干細胞誘導分化后為神經(jīng)元樣細胞后表達上述神經(jīng)營養(yǎng)因子含量下降,以CNTF及BDNF下降最明顯。3.在誘導7天和14天時,上述神經(jīng)營養(yǎng)因子表達量相當。 目的：研究骨髓間充質(zhì)干細胞移植于切斷脛神經(jīng)遠端觀察表達上述神經(jīng)營養(yǎng)因子以及向神經(jīng)元樣細胞分化的情況；進一步觀察骨髓間充質(zhì)干細胞延緩失神經(jīng)支配的骨骼肌萎縮作用和沉默骨髓間充質(zhì)干細胞表達CNTF對延緩失神經(jīng)骨骼肌萎縮的影響。 方法：取成年Wistar雄性大鼠,分為4組：Ⅰ,對照組(n=24)；Ⅱ,CNTF注射組(n=24)；Ⅲ,RNA干擾沉默CNTF表達的骨髓間充質(zhì)干細胞移植組(n=24)；Ⅳ,骨髓間充質(zhì)干細胞移植組(n=24)。每組大鼠的遠端脛神經(jīng)分別被注射5ulDMEM, 5ulCNTF,2.5×105RNA干擾沉默CNTF表達的骨髓間充質(zhì)干細胞和2.5×105骨髓間充質(zhì)干細胞。分別于術(shù)后4、8和12周獲取標本行腓腸肌張力、腓腸肌濕重比率、腓腸肌纖維橫截面積維持率及三色染色觀察肌萎縮情況；同時行在12周時行骨髓基質(zhì)干細胞標志物CD44、CD90；神經(jīng)元標志物NF、GFAP及神經(jīng)營養(yǎng)因子BDNF、NGF、NT3、CNTF和GDNF免疫熒光染色觀察骨髓間充質(zhì)干細胞表達神經(jīng)營養(yǎng)因子與分化情況以及掃描電鏡觀察神經(jīng)肌肉接頭處突觸后膜變化情況。 結(jié)果：在移植后4、8和12周腓腸肌肌張力測試發(fā)現(xiàn),在所有各組肌張力呈持續(xù)下降趨勢,特別是Ⅰ組；而且腓腸肌濕重比率、腓腸肌纖維橫截面積維持率下降趨勢與肌張力變化相似；各組間兩兩比較,結(jié)果顯示腓腸肌濕重比率、腓腸肌纖維橫截面積維持率,Ⅳ組與Ⅰ組、Ⅱ組比較差異有顯著性(P0.05)；Ⅲ組與Ⅰ組、Ⅱ組比較差異有顯著性(P＜0.05)；Ⅱ組與Ⅰ組比較差異有顯著性(P0.05)；然而,Ⅲ組與Ⅳ組比較差異無顯著性(P＞0.05)。腓腸肌三色染色發(fā)現(xiàn),Ⅰ組肌纖維大部分被膠原纖維組織替代,Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組尚有肌纖維組織得以保持,其中,Ⅳ組優(yōu)于Ⅲ組優(yōu)于Ⅱ組。在細胞移植后12周取遠側(cè)脛神經(jīng)標本行免疫熒光染色,發(fā)現(xiàn)骨髓基質(zhì)干細胞標志物CD90呈陽性,同時行神經(jīng)營養(yǎng)因子BDNF、NGF、NT3、CNTF和GDNF染色呈陽性,而神經(jīng)元標志物NF、GFAP呈陰性。進行描電鏡顯示,Ⅳ組神經(jīng)肌肉接頭處突觸后膜皺襞深度與密度優(yōu)于Ⅲ組優(yōu)于Ⅱ組優(yōu)于Ⅰ組。 結(jié)論：1.骨髓基質(zhì)干細胞具有延緩失神經(jīng)骨骼肌肌萎縮的作用；；2.骨髓基質(zhì)干細胞在缺少某種神經(jīng)營養(yǎng)因子--CNTF的情況下延緩失神經(jīng)骨骼肌肌萎縮的作用未發(fā)生改變；3.骨髓基質(zhì)干細胞之所以能夠延緩失神經(jīng)骨骼肌肌萎縮可能因為在周圍神經(jīng)中存活并分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子,而不是分化為神經(jīng)元樣細胞；4.突觸后膜的變化與腓腸肌形態(tài)與功能的變化一致,我們推猜骨髓基質(zhì)干細胞表達的神經(jīng)營養(yǎng)因子是通過神經(jīng)肌肉接頭處的突觸后膜發(fā)揮延緩失神經(jīng)骨骼肌肌萎縮。 摘要目的：研究骨髓間充質(zhì)干細胞對突觸后膜AchR表達的影響及引起其變化的細胞信號轉(zhuǎn)導通路情況。 方法：將Sol8肌管細胞培養(yǎng)于含10%FBS的高糖DMEM中待其達到60%融合時,通過構(gòu)建慢病毒載體(LVTHM)將AchR和ERBB3共轉(zhuǎn)染Sol8肌管細胞,通過RT-PCR驗證轉(zhuǎn)染效率；將共轉(zhuǎn)染后的Sol8肌管細胞與傳第三代的骨髓基質(zhì)干細胞共培養(yǎng)48小時；實驗分兩組：A：Sol8肌管細胞組；B：共培養(yǎng)組；通過Western blot測定Sol8肌管細胞AchR表達情況以及細胞信號轉(zhuǎn)導通路ERBB3(細胞膜)→Ras→Raf→MAPK(細胞質(zhì))的變化情況。 結(jié)果：經(jīng)RT-PCR測定發(fā)現(xiàn)Erbb3轉(zhuǎn)染率為84.3%,AChRδ轉(zhuǎn)染率為83.3%Western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn),骨髓間充質(zhì)干細胞與共轉(zhuǎn)染后的Sol8肌管細胞共培養(yǎng)48hr后觀察發(fā)現(xiàn),AChRδ表達增加,細胞膜ErbB3表達上調(diào),同時發(fā)現(xiàn)Sol8肌管細胞內(nèi)Ras、Raf、MAPK細胞信號蛋白表達增加。 結(jié)論：1.骨髓間充質(zhì)干細胞能使突觸后膜AchR表達上調(diào)；2.其機制是通過ERBB3(細胞膜)→Ras→Raf→MAPK(細胞質(zhì))信號轉(zhuǎn)導通路。
【圖文】：

圖1.7:誘導7天呈神經(jīng)元樣細胞改變的骨髓間充質(zhì)干細胞進行流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)Nestin陽性率40.17%士2.95%，NF陽性率160，0士1.23%，p一tubulinlll陽性率19.000，0士1.58%，MAp一2陽性率36二30%士1.78%，GFAP陽性率39.17%士1.95%，CHAT陽性率19.30%士1.38%。

圖2:ELISA定{，卜分析傳1(PI)、3(P3)、5(PS)代·{’全髓I’，.1充質(zhì)}幾細胞和誘學7人(D7d)及誘導14天(D14d)后}幾述辛，}，經(jīng)價養(yǎng)囚護的表達情況。，出髓間允質(zhì)}一細胞在傳3代時，除了NT3外其它四科‘因J二表達處J幾最高峰，尤其是CNTF;其‘1，，，CNTF的表達{，會是NT3{I勺15信以卜;又寸比傳l、3、5代側(cè)，髓l’!IJ充質(zhì)l飛細胞發(fā)現(xiàn)CNTFI’{勺變化范l!。1少J幾l信，而BDNF變化貝lJ多J幾8倍。被誘導后的·}寸髓從)貢I‘細胞表達1幾述子，1，經(jīng)價養(yǎng)囚子的能力卜降，特別是CTNF和BDNF;在誘浮7天時和誘濘14人時相比，NGF、BDNF、GDNF表達{「卜較多，一flzCNTF不}一NT3表達量則111各了J一卜‘降
【學位授予單位】：復旦大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R329

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本文編號：2581577