【摘要】： 目的本研究旨在建立一種標(biāo)準(zhǔn)的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(umbilicalcord derived mesenchymal stem cells,UC-MSCs)分離方法,通過(guò)對(duì)其基本生物學(xué)特性、安全性、免疫學(xué)特性及臨床治療移植物抗宿主病作用的研究,以期建立臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞庫(kù)及應(yīng)用于臨床。 方法本實(shí)驗(yàn)研究分五部分:1.采用雙酶法分離臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞,并通過(guò)傳代進(jìn)行純化和擴(kuò)增培養(yǎng),繪制生長(zhǎng)曲線;用流式細(xì)胞儀檢測(cè)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞表面抗原及細(xì)胞周期;誘導(dǎo)向成骨、脂肪分化以觀察其多項(xiàng)分化潛能;采用軟瓊脂克隆實(shí)驗(yàn)以觀察其致瘤性;急性毒性實(shí)驗(yàn)以觀察其急性毒性反應(yīng)。2.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)其免疫表型;用Brdu法測(cè)定細(xì)胞增殖率,觀察UC-MSCs對(duì)異體T淋巴細(xì)胞增殖的影響;流式細(xì)胞儀檢測(cè)共培養(yǎng)體系中CD4~+、CD8~+水平;ELISA法檢測(cè)共培養(yǎng)上清細(xì)胞因子IL-4、IFN-γ的表達(dá)水平3.以雄性C57BL/6(H  2k~b)小鼠為供鼠、照射后的雌性BALB/c (H  2k~d)小鼠為受鼠,在移植物中混合不同比例的供鼠脾淋巴細(xì)胞以誘導(dǎo)急性移植物抗宿主病。根據(jù)臨床表現(xiàn)、存活期及病理檢查等判斷GVHD程度,以建立穩(wěn)定的小鼠aGVHD模型。4.采用雄性C57BL/6(H  2k~b)小鼠為供鼠、銫(Cs)137致死量照射的雌性BALB/c (H  2k~d)小鼠為受鼠建立不同的移植組:照射組、GVHD組、治療組。根據(jù)生存率、臨床表現(xiàn)和病理改變判斷GVHD程度,并比較不同移植組的存活率、GVHD發(fā)生情況。5.于2006年10月～2007年2月,應(yīng)用臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療3例GVHD患者(急性GVHD患者1例,慢性GVHD患者2例)。從足月兒臍帶分離出來(lái)間充質(zhì)干細(xì)胞,在體外經(jīng)過(guò)分離培養(yǎng)后,制成臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞懸液,靜脈輸注患者體內(nèi)進(jìn)行療效觀察。 結(jié)果成功建立了臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分離及培養(yǎng)擴(kuò)增的方法;流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示,貼壁細(xì)胞均表達(dá)CD29、CD44、CD166、CD105、CD106,不表達(dá)造血細(xì)胞表型CD34、CD45和CD31;細(xì)胞倍增時(shí)間為30 h ,細(xì)胞周期分析表明,G0～G1期和S+ G2 + M期所占比例分別為78. 84 %和11. 16 % ,臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞在軟瓊脂中無(wú)克隆形成、無(wú)急性毒性反應(yīng)。從臍帶獲得的MSCs免疫表型分析顯示,其不表達(dá)HLA-II抗原、CD80、CD86。對(duì)PHA刺激的臍帶血T淋巴細(xì)胞,UC-MSCs對(duì)其的增殖反應(yīng)具有抑制作用;UC-MSCs與臍帶血單個(gè)核細(xì)胞共培養(yǎng)體系中, CD8+細(xì)胞比例降低,與對(duì)照組有顯著性差異(P 0101),CD4+細(xì)胞比例無(wú)明顯變化(P 0.05);UC-MSCs抑制了共培細(xì)胞養(yǎng)體系中IFN-γ分泌,然而促進(jìn)了IL-4的分泌,與對(duì)照組有顯著性差異( P 0.01)。異基因骨髓移植組無(wú)典型的急性GVHD,aGVHD組的臨床評(píng)分在8分左右,存活期集中在14-30天,臨床和病理均可在相對(duì)集中的時(shí)間內(nèi)觀察到典型的急性GVHD改變.在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中,發(fā)現(xiàn)開(kāi)始輸注間充質(zhì)干細(xì)胞,能夠預(yù)防和減輕GVHD的發(fā)生。和GVHD組比較,治療組生存期、GVHD臨床癥狀和皮膚病理變化具有明顯好轉(zhuǎn),具有顯著性差異(p0.05)。在臨床觀察中,臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞輸注后所有患者均未見(jiàn)不良反應(yīng);隨訪1月,3例急慢性GVHD例患者具有不同程度恢復(fù)。 結(jié)論雙酶法是一種較好的分離間充質(zhì)干細(xì)胞的方法,培養(yǎng)的細(xì)胞具有間充質(zhì)干細(xì)胞的基本特性,無(wú)致瘤性和急性毒性反應(yīng),為建立間充質(zhì)干細(xì)胞庫(kù)和臨床應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。UC-MSCs能夠抑制PHA刺激的T淋巴的增殖,改變T細(xì)胞亞群及T細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子,這種抑制特性表明, UC-MSCs對(duì)免疫反應(yīng)具負(fù)調(diào)節(jié)作用,可能為GVHD的防治以及自身免疫性疾病治療提供一條新途徑,有助UC-MSCs的臨床應(yīng)用。成功地建立了小鼠GVHD模型,可用于評(píng)價(jià)抗GVHD的治療效果。UC-MSCs能夠減輕急性GVHD的程度和發(fā)生。UC-MSCs移植治療GVHD是一種簡(jiǎn)單、安全、有效的方法,值得進(jìn)一步開(kāi)展臨床觀察和驗(yàn)證。
【圖文】：

test;所有統(tǒng)計(jì)學(xué)處理均采用 SPSS10.0 統(tǒng)計(jì)軟件處理，p<0.05 為差異有顯著性意義。結(jié) 果1 臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 采用本方法分離的原代細(xì)胞多于 24-48 小時(shí)內(nèi)貼壁，培養(yǎng) 3－5 天，倒置顯微鏡可見(jiàn)貼壁細(xì)胞呈梭形、多角形，6－10 天以后增長(zhǎng)速度增快，可見(jiàn)成纖維細(xì)胞樣克隆形成，，此后增生成為形態(tài)相對(duì)均一的梭形細(xì)胞，呈平行排列生長(zhǎng)或旋渦狀生長(zhǎng)，于第 2-3 周可形成大于 80%融合貼壁細(xì)胞層。連續(xù)傳 20 代，細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯改變。而采用文獻(xiàn)報(bào)道的內(nèi)皮消化法只有 30%標(biāo)本可以分離出 MSCs，70%標(biāo)本貼壁細(xì)胞傳代不能超過(guò) 2 代。（Fig1）。

Channels (FL2-A)0 40 80 120 160 200圖 3:臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞周期分析78.84 % 細(xì)胞在 G0-G1 期 和 11.16%細(xì)胞在 S+G2+M 期Fig3. Cell cycle analysis of UC-MSCs78.84% cells in G0-G1 phase and 11.16% cells in S+G2+M phase4 臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的免疫表型分析 流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果如下(見(jiàn)圖 6)：
【學(xué)位授予單位】：福建醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號(hào)】：R392

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本文編號(hào)：2581044