【摘要】： 腎綜合征出血熱(hemorrhagic fever with renal syndrome,HFRS)是由漢坦病毒(Hantavirus,HTV)引起,由鼠類等傳播的自然疫源性疾病,主要臨床特征為發(fā)熱、出血、腎臟損害,病死率高。我國是世界上腎綜合征出血熱疫情最嚴(yán)重的國家,年發(fā)病人數(shù)在2-5萬左右,且新疫區(qū)不斷出現(xiàn),并時(shí)有暴發(fā)流行。臨床上目前尚缺乏特異有效的治療藥物,因此,HFRS嚴(yán)重威脅著人類的健康。 目前我國已經(jīng)成功研制出三類出血熱滅活疫苗,包括乳鼠腦純化滅活疫苗(HTN型)、細(xì)胞培養(yǎng)滅活單價(jià)疫苗(沙鼠腎細(xì)胞HTN型疫苗、地鼠腎細(xì)胞SEO型疫苗)和雙價(jià)疫苗(HTN型和SEO型)。雖然滅活疫苗的研制成功對預(yù)防HFRS的發(fā)生和流行起到了積極作用,但通過使用發(fā)現(xiàn)該類疫苗仍存在一些問題:主要是其不能有效地刺激細(xì)胞免疫應(yīng)答,此外誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的能力也較弱,抗體滴度不高。因此研制更為有效的疫苗是預(yù)防HFRS發(fā)生和流行急需解決的問題。 HFRS的病原體為漢坦病毒,屬于布尼亞病毒科(Bunyaviridae),漢坦病毒屬(Hantavirus),是一類有包膜分節(jié)段的單負(fù)鏈RNA病毒,基因組包括L、M、S 3個(gè)片段,分別編碼RNA聚合酶、包膜糖蛋白(glycoprotein, GP)G1和G2、核衣殼蛋白(nucleocapsid, NP)。 M基因編碼的GP可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性中和抗體,且中和抗原位點(diǎn)主要位于G2糖蛋白上。S基因編碼的NP上亦分布有多個(gè)抗原表位,此外,NP還可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的細(xì)胞免疫反應(yīng),參與機(jī)體對病毒的清除。研究表明GP的免疫原性較弱,誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體出現(xiàn)較晚且滴度不高。而NP是漢坦病毒結(jié)構(gòu)蛋白中免疫原性最強(qiáng)的,其刺激機(jī)體產(chǎn)生的抗體出現(xiàn)早,滴度高,且可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫保護(hù)。因此將二者融合表達(dá),有望達(dá)到優(yōu)勢互補(bǔ)的目的。 在之前的研究中,我們將M基因與S基因的0.7Kb片段進(jìn)行了融合表達(dá),用嵌合基因免疫小鼠,可刺激小鼠同時(shí)產(chǎn)生針對病毒的特異性體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)。然而在研究中我們也發(fā)現(xiàn)了一些問題,如盡管利用各種系統(tǒng)均能表達(dá)出完整的融合蛋白,但總的來說蛋白表達(dá)量還是偏低。此外,免疫小鼠后雖然各表達(dá)系統(tǒng)均能刺激機(jī)體產(chǎn)生體液及細(xì)胞免疫應(yīng)答,且腺病毒表達(dá)系統(tǒng)的效果要優(yōu)于其他系統(tǒng),但是整體的免疫水平還不十分理想。因此,進(jìn)一步選擇合適的表達(dá)載體、優(yōu)化表達(dá)系統(tǒng)并使抗原分子更為有效的遞呈,以提高嵌合基因的表達(dá)量及其刺激機(jī)體免疫應(yīng)答的能力,是目前HFRS基因工程疫苗研究中急需解決的問題。之前,我們已經(jīng)將腺病毒表達(dá)系統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控結(jié)構(gòu)進(jìn)行了優(yōu)化,即引入CAG啟動(dòng)子與WPRE轉(zhuǎn)錄后調(diào)控序列。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),使用CAG后,腺病毒中嵌合基因的表達(dá)水平提高兩倍左右且高于單獨(dú)或同時(shí)使用WPRE組。本課題擬在前期已優(yōu)化轉(zhuǎn)錄調(diào)控結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上,聯(lián)合應(yīng)用抗原加工遞呈分子基因HSP70C(熱休克蛋白70氨基端片段編碼基因)與Ub基因,以進(jìn)一步提高嵌合基因表達(dá)抗原的加工和提呈,特別是進(jìn)一步提高刺激體液以及細(xì)胞免疫應(yīng)答的能力。 1.轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建 依據(jù)Genbank序列,設(shè)計(jì)引物,PCR擴(kuò)增得到HSP70C基因和Ub基因并分別克隆入T easy載體測序驗(yàn)證其正確性。隨后將HSP70C和Ub分別插入pShuttle-G1S0.7-CAG.、pShuttle-G2S0.7-CAG中,重組的轉(zhuǎn)移載體經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化后,瓊脂糖凝膠電泳分析,陽性克隆命名為pShuttle-G1S0.7-CAG-HSP70C、pShuttle-G2S0.7-HSP70C、pShuttle-G1S0.7- CAG-Ub、pShuttle-G1S0.7-CAG-Ub。 2.重組腺病毒DNA的構(gòu)建 將重組的轉(zhuǎn)移載體用PI-SceⅠ和I-CeuⅠ酶切后與Adeno-XTM Viral DNA連接,利用PCR鑒定重組的腺病毒DNA。 3.重組腺病毒的包裝及鑒定 將含目的片段的重組腺病毒DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌進(jìn)行大量擴(kuò)增純化,并測定濃度。利用PacⅠ線性化重組腺病毒DNA后轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞。觀察細(xì)胞的CPE現(xiàn)象,通過反復(fù)凍融裂解細(xì)胞獲得病毒原種。取病毒原種加入感染HEK293細(xì)胞,獲得病毒初次擴(kuò)增產(chǎn)物,并用PCR法鑒定重組腺病毒。 4.重組腺病毒的純化與滴度測定 用病毒初次擴(kuò)增產(chǎn)物感染單層HEK293細(xì)胞,將瓊脂糖凝膠與DMED混合物覆蓋其上,進(jìn)行噬斑實(shí)驗(yàn)。待出現(xiàn)噬斑后,挑取單斑獲得純病毒。從單層細(xì)胞的一個(gè)單斑中獲得病毒并擴(kuò)大培養(yǎng)。利用終點(diǎn)稀釋法測病毒的滴度,純化后的重組腺病毒滴度達(dá)109pfu/mL。 5.重組腺病毒表達(dá)產(chǎn)物的鑒定 以100 pfu/cell的MOI感染HEK293細(xì)胞,在24-48 h檢測細(xì)胞中蛋白的表達(dá)。免疫熒光結(jié)果表明,重組腺病毒感染的HEK293細(xì)胞均可被抗?jié)h坦病毒NP的特異性mAb1A8所識別。重組腺病毒Ad-G1S0.7-CAG-HSP70C及Ad-G2S0.7-CAG-HSP70C感染的HEK293細(xì)胞可被HSP70的特異性抗體識別,重組腺病毒Ad-G1S0.7-CAG-Ub及Ad-G2S0.7-CAG-Ub感染的HEK293細(xì)胞可被Ub的特異性抗體識別。
【圖文】：

第四軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文-41-圖2 重組質(zhì)粒T easy- HSP70C測序后BLAST比對結(jié)果Fig.2 BLAST Result of recombinant plasmid T easy-HSP70C3.2 Ub 基因的 PCR 擴(kuò)增結(jié)果以Ub up primer與Ub down primer 為引物，對質(zhì)粒進(jìn)行PCR擴(kuò)增，預(yù)期

與預(yù)期相符合（圖3）。將質(zhì)粒將送至金斯瑞生物科技進(jìn)行測序，，利用NCBI的BLAST工具與預(yù)先獲得的HSP70C序列信息進(jìn)行比對，一致性達(dá)100%（圖4），陽性克隆命名為T easy-Ub。圖 3 重組質(zhì)粒 T easy-Ub 的 PCR 鑒定結(jié)果Fig.3 PCR products of recombinant plasmid T easy-UbM：DL2000 DNA maker；1：T easy-Ub PCR products．圖4 重組質(zhì)粒Ub測序后BLAST比對結(jié)果Fig.2 BLAST Result of recombinant plasmid T easy-Ub1 M bp500250100
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R392;Q789

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2579253