發(fā)布時間：2020-02-11 05:46

【摘要】： 目的：通過建立煙曲霉菌絲感染人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cell HUVEC)的體外模型,①觀察煙曲霉菌絲感染后HUVEC表達組織因子(tissue factor TF)和血管假性血友病因子(von Willebrand Factor vWF)的水平；②分別用細胞松弛素D、N-鈣粘蛋白單克隆抗體或地塞米松處理HUVEC,觀察煙曲霉菌絲感染后HUVEC表達TF和vWF的變化,以探討侵襲性曲霉病血管侵襲的機制。 方法：接種于24孔板的HUVEC長滿融合后,加入預先配置的濃度為1×105CFU/ml煙曲霉菌絲懸液,建立煙曲霉菌絲感染血管內皮細胞模型。實驗分為六組,每組總反應體積200μl,即①空白對照組：細胞不予任何刺激；②TNF-α組：細胞予TNF-α(濃度100 ng／ml)刺激；③煙曲霉菌絲組：煙曲霉菌絲懸液濃度為105 CFU/ml;④細胞松弛素D組：HUVEC長滿融合后,實驗前10min用細胞松弛素D溶液處理,加入配制好的煙曲霉菌絲懸液(細胞松弛素D終濃度為70 nmol/L,煙曲霉菌絲懸液濃度為105 CFU/ml);⑤N-鈣粘蛋白抗體組：HUVEC細胞長滿融合,予濃度1：100的小鼠抗人N-鈣粘蛋白單克隆抗體處理1h后,加入配制好的煙曲霉菌絲懸液(煙曲霉菌絲懸液濃度為105CFU/ml);⑥地塞米松組：地塞米松和煙曲霉菌絲同時加入(地塞米松濃度為10-4mol／L,煙曲霉菌絲懸液濃度為105CFU/ml)。加入煙曲霉菌絲后,分別于共培養(yǎng)0、2、6、12、18h終止實驗以獲取細胞凍融液和2、6、12、18h提取細胞培養(yǎng)上清液,采用ELISA法分別檢測TF、vWF濃度。 結果： 一、TF變化：除空白對照組外,各實驗組HUVEC的TF表達量在2、6、12、18h與0h比較均升高(P0.05),而空白對照組則無明顯變化；各組間0h的TF表達量差異無統(tǒng)計學意義；各實驗組HUVEC的TF表達量在2、6、12、18h高于空白對照組(P0.05)；TNF-α組HUVEC的TF表達量在2、6、12h分別為503.64±53.26ng/L、1272.60±186.38ng/L、908.97±133.11 ng／L,明顯高于煙曲霉菌絲組相應時間點的387.33±57.05 ng／L、523.56±74.26ng／L、659.76±91.40 ng／L(P0.01)；細胞松弛素D組與煙曲霉菌絲組比較,TF表達量在各時間點差異均無統(tǒng)計學意義；N-鈣粘蛋白抗體組的TF表達量在2、6、12h分別為300.12±47.31ng/L.378.61±72.27ng/L、509.86±67.57ng/L,低于煙曲霉菌絲組相應時間點的387.33±57.05 ng/L.523.56±74.26 ng/L.659.76±91.40 ng/L(P0.05)；地塞米松組與煙曲霉菌絲組比較,HUVEC的TF表達量在各時間點差異均無統(tǒng)計學意義。 二、vWF變化：與2h比較,空白對照組和TNF-α組的vWF表達量在18h增加(P0.05),其余各組vWF表達量在6、12、18h均增加(P0.05)；各實驗組與空白對照組比較,除N-鈣粘蛋白抗體組HUVEC的vWF表達量在2h無明顯變化外,其余各時間點vWF表達量在2、6、12、18h均升高(P0.05)；TNF-α組HUVEC的vWF表達量在2h為64.45±7.58ng/mL,高于煙曲霉菌絲組51.49±6.41 ng/mL(P0.05),而在18h為91.05±18.90 ng/mL,低于煙曲霉菌絲組133.73±19.49 ng/mL(P0.05)；細胞松弛素D組HUVEC的vWF表達量與煙曲霉菌絲組比較在各時間點差異均無統(tǒng)計學意義；N-鈣粘蛋白抗體組HUVEC的vWF表達量在2h、6h分別為38.95±6.26 ng/mL和61.99±5.41 ng/mL,低于煙曲霉菌絲組相應時間點的51.49±6.41ng/mL和78.66±10.43 ng/mL(P0.05)；地塞米松組與煙曲霉菌絲組vWF表達量在各時間點差異均無統(tǒng)計學意義。 結論：本實驗結果提示：①建立煙曲霉菌絲感染HUVEC的體外模型是可行的；②煙曲霉菌絲感染造成HUVEC損傷,過度表達TF和vWF；③細胞松弛素D對煙曲霉菌絲感染后HUVEC表達TF及vWF無明顯影響；④N-鈣粘蛋白單克隆抗體可抑制煙曲霉菌絲感染后HUVEC表達TF及vWF；⑤地塞米松對煙曲霉菌絲感染的HUVEC表達TF及vWF無明顯影響。 第二部分煙曲霉菌絲誘導HUVEC凋亡 目的：應用煙曲霉菌絲感染HUVEC體外模型,觀察煙曲霉菌絲感染后HUVEC的凋亡情況。 方法：建立煙曲霉菌絲感染HUVEC的體外模型(具體同第一部分)。實驗分三組：①空白對照組,細胞不予任何刺激；②煙曲霉菌絲組I(濃度105CFU/mL)；③煙曲霉菌絲組Ⅱ(濃度106CFU/ml).用流式細胞儀于2、4、8h三個時相點檢測HUVEC凋亡率。 結果：除空白對照組外,暴露于煙曲霉菌絲組Ⅰ和Ⅱ的HUVEC凋亡率在2、4、8h逐漸增加(P0.05)；煙曲霉菌絲組I2、4、8h的HUVEC凋亡率分別為9.76±1.47%、13.47±1.83%、20.08±2.36%,明顯高于空白對照組相應時間點的1.61±0.17%、1.72±0.16%、1.84±0.18%(P0.01)；煙曲霉菌絲組Ⅱ2、4、8 h的HUVEC凋亡率分別為12.25±1.44%、16.57±2.28%、24.31±3.37%,也明顯高于空白對照組相應時間點的HUVEC凋亡率(P0.01),且高濃度煙曲霉菌絲引起細胞凋亡率高于低濃度煙曲霉菌絲(P0.05)。 結論：煙曲霉菌絲可誘導HUVEC凋亡。一定時間內,隨HUVEC接觸菌絲時間的延長,凋亡率增加；相同時間點,煙曲霉菌絲濃度越高,HUVEC凋亡率越高。
【圖文】：

各組TF表達量注:與oht匕較，，*P<0.05，**P<0.0一;與空白對照組比較，莽P<0.05，“岸P<0.01;

各組vWF表達量注:與oh比較，*P<0.05，**P<0.01;與空白對照組比較，岸P<0.05，洲燈P<0.01;與煙曲霉菌絲組比較，爭<0.05
【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R363

【參考文獻】

相關期刊論文 前6條

1 冼健坤;陳蒙華;謝露;阮紅;黎靜;;大劑量腎上腺素對血管內皮細胞表達血管性血友病因子的影響[J];廣西醫(yī)科大學學報;2009年02期

2 陳麗華,劉雪松,金伯泉;腫瘤壞死因子α作用后臍靜脈內皮細胞質內鈣離子的變化[J];醫(yī)學研究生學報;2003年01期

3 蔣建霞,汪玄,華寶來,潘家綺,趙永強;地塞米松對內毒素作用下人臍靜脈內皮細胞表達組織因子、凝血酶調節(jié)蛋白和蛋白S的影響[J];血栓與止血學;2004年04期

4 榮令;周新;李峰;何牡丹;;侵襲性肺曲霉病小鼠的凝血功能異常及低分子肝素的治療作用[J];中國呼吸與危重監(jiān)護雜志;2008年06期

5 韋立新;唐慶賀;孫璐;石懷銀;郭愛桃;游聯(lián)璧;;人體冠狀動脈粥樣硬化斑塊中氧化低密度脂蛋白和新生血管與斑塊穩(wěn)定性的關系[J];中華病理學雜志;2006年03期

6 徐赤宇;溫海;王溪濤;朱紅梅;顧菊林;羅平;王喜國;;新生隱球菌胞外蛋白水解酶對腦微血管內皮細胞的作用[J];中國真菌學雜志;2006年04期

本文編號：2578387