【摘要】： 目的：通過(guò)建立煙曲霉菌絲感染人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cell HUVEC)的體外模型,①觀察煙曲霉菌絲感染后HUVEC表達(dá)組織因子(tissue factor TF)和血管假性血友病因子(von Willebrand Factor vWF)的水平；②分別用細(xì)胞松弛素D、N-鈣粘蛋白單克隆抗體或地塞米松處理HUVEC,觀察煙曲霉菌絲感染后HUVEC表達(dá)TF和vWF的變化,以探討侵襲性曲霉病血管侵襲的機(jī)制。 方法：接種于24孔板的HUVEC長(zhǎng)滿融合后,加入預(yù)先配置的濃度為1×105CFU/ml煙曲霉菌絲懸液,建立煙曲霉菌絲感染血管內(nèi)皮細(xì)胞模型。實(shí)驗(yàn)分為六組,每組總反應(yīng)體積200μl,即①空白對(duì)照組：細(xì)胞不予任何刺激；②TNF-α組：細(xì)胞予TNF-α(濃度100 ng／ml)刺激；③煙曲霉菌絲組：煙曲霉菌絲懸液濃度為105 CFU/ml;④細(xì)胞松弛素D組：HUVEC長(zhǎng)滿融合后,實(shí)驗(yàn)前10min用細(xì)胞松弛素D溶液處理,加入配制好的煙曲霉菌絲懸液(細(xì)胞松弛素D終濃度為70 nmol/L,煙曲霉菌絲懸液濃度為105 CFU/ml);⑤N-鈣粘蛋白抗體組：HUVEC細(xì)胞長(zhǎng)滿融合,予濃度1：100的小鼠抗人N-鈣粘蛋白單克隆抗體處理1h后,加入配制好的煙曲霉菌絲懸液(煙曲霉菌絲懸液濃度為105CFU/ml);⑥地塞米松組：地塞米松和煙曲霉菌絲同時(shí)加入(地塞米松濃度為10-4mol／L,煙曲霉菌絲懸液濃度為105CFU/ml)。加入煙曲霉菌絲后,分別于共培養(yǎng)0、2、6、12、18h終止實(shí)驗(yàn)以獲取細(xì)胞凍融液和2、6、12、18h提取細(xì)胞培養(yǎng)上清液,采用ELISA法分別檢測(cè)TF、vWF濃度。 結(jié)果： 一、TF變化：除空白對(duì)照組外,各實(shí)驗(yàn)組HUVEC的TF表達(dá)量在2、6、12、18h與0h比較均升高(P0.05),而空白對(duì)照組則無(wú)明顯變化；各組間0h的TF表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；各實(shí)驗(yàn)組HUVEC的TF表達(dá)量在2、6、12、18h高于空白對(duì)照組(P0.05)；TNF-α組HUVEC的TF表達(dá)量在2、6、12h分別為503.64±53.26ng/L、1272.60±186.38ng/L、908.97±133.11 ng／L,明顯高于煙曲霉菌絲組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的387.33±57.05 ng／L、523.56±74.26ng／L、659.76±91.40 ng／L(P0.01)；細(xì)胞松弛素D組與煙曲霉菌絲組比較,TF表達(dá)量在各時(shí)間點(diǎn)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；N-鈣粘蛋白抗體組的TF表達(dá)量在2、6、12h分別為300.12±47.31ng/L.378.61±72.27ng/L、509.86±67.57ng/L,低于煙曲霉菌絲組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的387.33±57.05 ng/L.523.56±74.26 ng/L.659.76±91.40 ng/L(P0.05)；地塞米松組與煙曲霉菌絲組比較,HUVEC的TF表達(dá)量在各時(shí)間點(diǎn)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 二、vWF變化：與2h比較,空白對(duì)照組和TNF-α組的vWF表達(dá)量在18h增加(P0.05),其余各組vWF表達(dá)量在6、12、18h均增加(P0.05)；各實(shí)驗(yàn)組與空白對(duì)照組比較,除N-鈣粘蛋白抗體組HUVEC的vWF表達(dá)量在2h無(wú)明顯變化外,其余各時(shí)間點(diǎn)vWF表達(dá)量在2、6、12、18h均升高(P0.05)；TNF-α組HUVEC的vWF表達(dá)量在2h為64.45±7.58ng/mL,高于煙曲霉菌絲組51.49±6.41 ng/mL(P0.05),而在18h為91.05±18.90 ng/mL,低于煙曲霉菌絲組133.73±19.49 ng/mL(P0.05)；細(xì)胞松弛素D組HUVEC的vWF表達(dá)量與煙曲霉菌絲組比較在各時(shí)間點(diǎn)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；N-鈣粘蛋白抗體組HUVEC的vWF表達(dá)量在2h、6h分別為38.95±6.26 ng/mL和61.99±5.41 ng/mL,低于煙曲霉菌絲組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的51.49±6.41ng/mL和78.66±10.43 ng/mL(P0.05)；地塞米松組與煙曲霉菌絲組vWF表達(dá)量在各時(shí)間點(diǎn)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示：①建立煙曲霉菌絲感染HUVEC的體外模型是可行的；②煙曲霉菌絲感染造成HUVEC損傷,過(guò)度表達(dá)TF和vWF；③細(xì)胞松弛素D對(duì)煙曲霉菌絲感染后HUVEC表達(dá)TF及vWF無(wú)明顯影響；④N-鈣粘蛋白單克隆抗體可抑制煙曲霉菌絲感染后HUVEC表達(dá)TF及vWF；⑤地塞米松對(duì)煙曲霉菌絲感染的HUVEC表達(dá)TF及vWF無(wú)明顯影響。 第二部分煙曲霉菌絲誘導(dǎo)HUVEC凋亡 目的：應(yīng)用煙曲霉菌絲感染HUVEC體外模型,觀察煙曲霉菌絲感染后HUVEC的凋亡情況。 方法：建立煙曲霉菌絲感染HUVEC的體外模型(具體同第一部分)。實(shí)驗(yàn)分三組：①空白對(duì)照組,細(xì)胞不予任何刺激；②煙曲霉菌絲組I(濃度105CFU/mL)；③煙曲霉菌絲組Ⅱ(濃度106CFU/ml).用流式細(xì)胞儀于2、4、8h三個(gè)時(shí)相點(diǎn)檢測(cè)HUVEC凋亡率。 結(jié)果：除空白對(duì)照組外,暴露于煙曲霉菌絲組Ⅰ和Ⅱ的HUVEC凋亡率在2、4、8h逐漸增加(P0.05)；煙曲霉菌絲組I2、4、8h的HUVEC凋亡率分別為9.76±1.47%、13.47±1.83%、20.08±2.36%,明顯高于空白對(duì)照組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的1.61±0.17%、1.72±0.16%、1.84±0.18%(P0.01)；煙曲霉菌絲組Ⅱ2、4、8 h的HUVEC凋亡率分別為12.25±1.44%、16.57±2.28%、24.31±3.37%,也明顯高于空白對(duì)照組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的HUVEC凋亡率(P0.01),且高濃度煙曲霉菌絲引起細(xì)胞凋亡率高于低濃度煙曲霉菌絲(P0.05)。 結(jié)論：煙曲霉菌絲可誘導(dǎo)HUVEC凋亡。一定時(shí)間內(nèi),隨HUVEC接觸菌絲時(shí)間的延長(zhǎng),凋亡率增加；相同時(shí)間點(diǎn),煙曲霉菌絲濃度越高,HUVEC凋亡率越高。
【圖文】：

各組TF表達(dá)量注:與oht匕較，，*P<0.05，**P<0.0一;與空白對(duì)照組比較，莽P<0.05，“岸P<0.01;

各組vWF表達(dá)量注:與oh比較，*P<0.05，**P<0.01;與空白對(duì)照組比較，岸P<0.05，洲燈P<0.01;與煙曲霉菌絲組比較，爭(zhēng)<0.05
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類(lèi)號(hào)】：R363

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2578387