【摘要】：間充質(zhì)干細胞（Mesenchymal Stem Cells, MSC）具有免疫調(diào)節(jié)和分泌細胞因子等功能，在細胞治療和組織工程中具有重要的應(yīng)用價值，是目前除了造血干細胞之外臨床應(yīng)用研究最多、最成熟的一種成體干細胞。間充質(zhì)干細胞在組織中的豐度很低，要達到臨床應(yīng)用的數(shù)量級，就必須進行體外的擴增培養(yǎng)。胎牛血清常用作為細胞培養(yǎng)的營養(yǎng)和刺激物，可以實現(xiàn)MSC在體外的穩(wěn)定增殖。然而，胎牛血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的MSC，牛血清蛋白可被吞噬進入細胞漿，從而殘留在細胞內(nèi)，在臨床治療過程中可能引起患者機體免疫反應(yīng)，造成血清病或其他免疫性疾病。此外，胎牛血清還具有明顯的批次間差異，從而影響MSC培養(yǎng)的穩(wěn)定性。因此，化學(xué)成份確定的無血清培養(yǎng)基是培養(yǎng)安全、穩(wěn)定的臨床應(yīng)用級MSC的趨勢。然而，由于無血清培養(yǎng)基中缺乏大量細胞生長因子，間充質(zhì)干細胞增殖緩慢或不能增殖。更關(guān)鍵的是由于MSC是貼壁生長細胞，無血清培養(yǎng)基中缺乏各種粘附貼壁因子，如纖維連接蛋白、層粘連蛋白、膠原等，從而影響MSC的貼壁。因此，需要添加大量的細胞生長因子和細胞基質(zhì)蛋白包括纖維連接蛋白、膠原和胎球蛋白，以維持MSC的增殖和貼壁。事實上，MSC是一種分泌型細胞，本身具有分泌很多細胞因子、生長因子和一系列的細胞外基質(zhì)包括膠原和FN的能力。所以我們設(shè)想是否可以通過某種刺激，促進MSC自身分泌細胞外基質(zhì)和增殖，從而解決MSC增殖和貼壁的問題？如果可行，這將為研究間充質(zhì)干細胞無血清培養(yǎng)基提供一條新的思路。 通過文獻調(diào)研和預(yù)實驗的篩選，我們選擇了臨床藥物凝血酶作為刺激物。凝血酶是絲氨酸蛋白酶家族成員，具有多種生物學(xué)功能，其不僅在凝血過程發(fā)揮作用外，還能誘導(dǎo)細胞發(fā)生許多生物學(xué)效應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)凝血酶能夠刺激腎小球基底膜細胞合成膠原和刺激人腎小球近端小管上皮細胞分泌FN，還能誘導(dǎo)肥大細胞更易于貼壁和促進膠質(zhì)瘤細胞增殖和分泌神經(jīng)生長因子等。本課題主要就凝血酶對MSC的作用及其可能的作用機制進行探討，內(nèi)容包括凝血酶對間充質(zhì)干細胞分泌表達FN的作用及其作用的途徑，以及凝血酶對間充質(zhì)干細胞增殖及其他生物學(xué)特性的影響。 首先，我們利用傳統(tǒng)密度梯度分離和差速貼壁的方法，從健康供者骨髓中分離MSC，并經(jīng)流式鑒定和誘導(dǎo)分化鑒定后，作為實驗研究用細胞。為了觀察凝血酶是否具有對MSC作用的可能性，我們通過PCR方法檢測MSC是否表達凝血酶受體——蛋白酶活化受體（Protease activated receptors, PAR）。結(jié)果顯示MSC表達凝血酶受體PAR1和PAR2，說明凝血酶有可能通過PAR1和PAR2對MSC發(fā)揮作用。 之后，我們通過PCR、免疫熒光和ELISA等方法，在mRNA、蛋白質(zhì)和細胞水平，分別檢測凝血酶刺激后MSC表達FN的情況，通過1h細胞自然貼壁試驗檢測凝血酶刺激MSC后細胞貼壁率，PCR方法檢測細胞粘附分子ITGA。結(jié)果顯示，凝血酶作用后，MSC在RNA水平FN表達增高（是對照組3倍，p0.05）；分泌到細胞培養(yǎng)上清中的FN量明顯增高（p0.01），且具有明顯的時間效應(yīng)和濃度依賴性。同時，MSC細胞漿中FN表達量也明顯升高。經(jīng)過凝血酶預(yù)處理的MSC，貼壁能力明顯高于對照組（p0.01），與細胞粘附相關(guān)的因子ITGA5表達也增高。我們的結(jié)果說明，凝血酶可以促進MSC表達和分泌FN，并提高MSC貼壁能力。 為了進一步研究凝血酶促進MSC分泌FN的機制，通過WESTERNBLOTTING方法檢測凝血酶作用后信號通路激活情況。結(jié)果顯示，凝血酶作用后，ERK1/2信號通路發(fā)生快速磷酸化，在5min就達到峰值，并且至少持續(xù)60min。同時，凝血酶還誘導(dǎo)NFKB信號通路發(fā)生磷酸化，然而與ERK1/2信號通路不同的是，NFKB p65在60min才達到磷酸化的最高值。為了進一步研究哪一條信號通路在凝血酶刺激FN分泌中起主要的作用，我們用NFKB、EKR信號通路特異性抑制劑丙酮酸酯（EP）和PD98059分別阻斷NFKB和ERK的活化，然后用ELISA檢測MSC分泌FN情況。結(jié)果顯示，當(dāng)NFKB和ERK被阻斷后，F(xiàn)N分泌均下降，尤其以ERK通路被阻斷后，抑制效果更明顯（p0.01）。而NFKB通路被阻斷后，雖然FN的分泌受到了明顯的抑制，但是，培養(yǎng)上清中FN的濃度仍然明顯高于無血清對照組（p0.05）。 為進一步觀察凝血酶是通過哪個受體激活NFKB和ERK通路，我們用PAR1和PAR2受體特異性抑制劑SCH79797和FSLLRY-NH2，分別阻斷PAR1和PAR2受體，觀察凝血酶處理后MSC信號通路以及分泌FN的變化。結(jié)果顯示，PAR1受體被阻斷后，ERK信號通路快速磷酸化（5min）不受影響，但是其持續(xù)磷酸化作用被抑制，，F(xiàn)N分泌量較凝血酶單獨刺激對照組降低（p0.05），但仍然高于無血清對照組（p0.05）；而PAR2受體被抑制后，ERK信號通路被明顯抑制，同時FN分泌量被明顯抑制（p0.01），與無血清對照組相比無明顯差異。結(jié)果還顯示，PAR受體抑制劑對NFKB信號通路磷酸化影響不大。由此推測，凝血酶可能通過PAR受體激活ERK通路促進FN的分泌表達，同時還可能通過其它間接通路激活NFKB信號通路，影響FN的分泌表達。 此外，我們通過MTT方法和CFSE標(biāo)記MSC流式細胞術(shù)的方法，觀察了凝血酶對MSC增殖的影響，分析了經(jīng)凝血酶刺激培養(yǎng)的MSC，其細胞表面標(biāo)志物CD31, CD34, CD45, CD44, CD73, CD90, CD105和HLA-DR的表達，和α-tubulin免疫熒光方法分析MSC的細胞骨架結(jié)構(gòu)情況，以及MSC的體外分化能力和免疫調(diào)節(jié)功能的變化。MTT結(jié)果顯示，凝血酶可顯著刺激MSC增殖，效應(yīng)呈濃度依賴性；當(dāng)凝血酶濃度為0.5U/ml時，細胞增殖明顯提高(p0.05)，濃度為8U/ml時，刺激活性達峰值（p0.01）。流式結(jié)果顯示，凝血酶作用后MSC增殖代數(shù)明顯增加，增殖指數(shù)較對照組增高（P0.01），驗證了凝血酶具有促進MSC增殖的作用。而經(jīng)凝血酶刺激培養(yǎng)的MSC細胞表面標(biāo)志物、細胞骨架沒有發(fā)生明顯改變，并且依然保持誘導(dǎo)分化成骨細胞、脂肪細胞的能力和抑制異體淋巴細胞增殖轉(zhuǎn)化能力。 為了研究凝血酶促進MSC增殖的機制，探討PAR受體在凝血酶促進MSC增殖中的作用，我們使用PAR受體特異性抑制劑SCH79797和FSLLRY-NH2分別阻斷PAR1和PAR2受體，觀察凝血酶對MSC增殖作用的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)PAR1受體被阻斷后，凝血酶促進MSC增殖的作用被抑制（p0.05）；當(dāng)PAR2受體被抑制后，凝血酶促MSC增殖作用不受明顯影響。凝血酶作用后，AKT信號通路被激活，而當(dāng)AKT信號通路被抑制后，細胞增殖也被完全抑制。此外，凝血酶還能通過PAR1受體激活ERK1/2信號通路，通過特異性抑制劑證實，ERK1/2信號通路也與凝血酶促進MSC增殖作用有關(guān)。PCR方法檢測細胞增殖相關(guān)的基因表達發(fā)現(xiàn)，凝血酶作用后與調(diào)控細胞增殖相關(guān)的c-MYC、EGR1基因表達上調(diào)，并分別被AKT信號通路抑制劑和ERK1/2信號通路抑制劑抑制。由此推斷，在無血清培養(yǎng)基中添加凝血酶，可以通過PAR1受體激活A(yù)KT信號通路，上調(diào)c-MYC基因表達；通過PAR1受體激活ERK1/2信號通路，上調(diào)EGR1基因表達，促進MSC增殖。 上述研究結(jié)果可以得出如下結(jié)論：（1）凝血酶可以通過PAR受體介導(dǎo)的ERK1/2信號通路磷酸化，促進MSC自身FN的表達和分泌，并且間接激活的NFKB信號通路也參與了促進MSC表達和分泌FN的過程；（2）凝血酶可促進MSC在無血清培養(yǎng)基中的貼壁能力和粘附分子ITGA5的表達；（3）凝血酶可通過MSC表面PAR1受體，激活A(yù)KT和ERK1/2信號通路，上調(diào)c-MYC、EGR1基因的表達，促進MSC的增殖。研究也表明，經(jīng)凝血酶刺激的MSC仍然保持其原有的生物學(xué)特性，具有分化成骨細胞、脂肪細胞和免疫抑制能力。以上結(jié)果為研究適用于臨床級MSC培養(yǎng)的無血清體系，提供了一種新的策略。當(dāng)然，新培養(yǎng)體系進入臨床應(yīng)用前，仍需要進行更深入的研究，以探討新體系所培養(yǎng)細胞的安全性和穩(wěn)定性等。
【圖文】：

數(shù)據(jù)采用 SPSS13.0 或 GraphPad Prism 6 進行統(tǒng)計處理。定量資料以X±SD 表示。實驗組間采用單因素方差分析(ANOVO)，方差齊性且具有統(tǒng)計學(xué)意義時，采用 Dunnett's 多重比較檢驗方法對組間進行分析，p<0.05 認為具有明顯的統(tǒng)計學(xué)差異。結(jié) 果3. 結(jié)果3.1 骨髓 MSC 分離培養(yǎng)結(jié)果骨髓一直是 MSC 的主要來源之一，大約每萬分之一到百萬分之一個骨髓單個核細胞中含有一個原始 MSC，我們采用經(jīng)典的梯度密度離心和差速貼壁的方法成功的分離 MSC 并擴增培養(yǎng)。光學(xué)顯微鏡下觀察，培養(yǎng)第 3 天可見少量貼壁的紡錘形細胞和其他血細胞（圖 1-1A），第 7-10 天可見細胞呈集落樣生長（圖 1-1B），第 12-14 天可見集落呈較大的成纖維樣、魚群狀生長（圖 1-1C）。經(jīng)消化傳代后，獲得均一的細胞。（見圖 1-1D）A B

碩士論文 第一部分：凝血酶促進 MSC 分泌纖維連接蛋白及機制3.2 骨髓 MSC 流式鑒定結(jié)果根據(jù)國際細胞治療協(xié)會關(guān)于 MSC 鑒定的標(biāo)準(zhǔn)，我們對獲得的 MSC 進行流式細胞分析表面標(biāo)志物表達情況。結(jié)果顯示，獲得的細胞高表達 CD44, CD73, CD90,CD105, 不表達 CD34, CD45, CD31 和 HLA-DR （見圖 1-2），符合 MSC 的表達標(biāo)準(zhǔn)。
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R329.2

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本文編號：2574705