發(fā)布時(shí)間：2020-01-25 00:37

【摘要】：肝臟是人體內(nèi)重要的消化器官,調(diào)控著各種代謝平衡。由于其顯著的醫(yī)學(xué)價(jià)值,肝臟的再生過(guò)程受到了廣泛的關(guān)注和研究。但迄今為止,人們對(duì)于調(diào)控肝臟再生的分子機(jī)理研究的并不是十分透徹,雖然發(fā)現(xiàn)了一些調(diào)控再生過(guò)程的信號(hào)途徑和轉(zhuǎn)錄因子,但是許多調(diào)控肝臟再生過(guò)程的重要基因尚未發(fā)現(xiàn),這就使得人們對(duì)于肝臟的再生過(guò)程缺乏完整性認(rèn)識(shí),而這些問(wèn)題的解決將更有效地指導(dǎo)重大肝臟疾病的治療。 對(duì)于肝臟再生的研究比較普遍的是以小鼠作為模式生物,但由于此類動(dòng)物不適用于大規(guī)模正向遺傳突變的篩選工作,導(dǎo)致對(duì)于影響肝臟再生的重要分子的篩選工作并不全面,限制了研究的范圍,而斑馬魚(yú)肝臟再生正向突變篩選模型的建立恰好解決了這一問(wèn)題。 本實(shí)驗(yàn)中,首先構(gòu)建了轉(zhuǎn)基因質(zhì)粒Bluescript II-KS-I-lfabp-Dendra2-NTR將斑馬魚(yú)肝臟特異性啟動(dòng)子lfabp連接到Dendra2-NTR的上游,使肝臟細(xì)胞特異性表達(dá)細(xì)菌的硝基還原酶(NTR)和顯示綠色熒光。在斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育的單細(xì)胞時(shí)期注射0.15ng轉(zhuǎn)基因質(zhì)粒到動(dòng)物極細(xì)胞中,經(jīng)過(guò)幾代繁殖后篩選穩(wěn)定遺傳的lfabp:Dendra NTR轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)系,用于肝臟再生正向突變篩選實(shí)驗(yàn)以及肝臟再生細(xì)胞來(lái)源的研究。 Mtz/NTR系統(tǒng)特異性介導(dǎo)斑馬魚(yú)胚胎肝臟損傷以及恢復(fù)的主要理論依據(jù)為當(dāng)肝臟細(xì)胞特異性表達(dá)NTR的斑馬魚(yú)胚胎培養(yǎng)在含有甲硝噠唑(Mtz)的溶液中時(shí),NTR被NADH或NADPH還原后與Mtz結(jié)合,將無(wú)毒性的Mtz轉(zhuǎn)化為有細(xì)胞毒性的代謝物,特異性致使表達(dá)NTR的肝臟細(xì)胞死亡。撤去藥物后,經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的恢復(fù)肝臟細(xì)胞可以再生。通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明,用10mM Mtz處理lfabp:Dendra2 NTR轉(zhuǎn)基因系斑馬魚(yú)胚胎26小時(shí)后的處理組與對(duì)照組相比,處理組的胚胎肝臟明顯變小,當(dāng)繼續(xù)用10mM Mtz處理達(dá)48小時(shí)后,通過(guò)共聚焦顯微鏡的仔細(xì)觀察沒(méi)有發(fā)現(xiàn)任何殘存的肝臟細(xì)胞,并且經(jīng)過(guò)24小時(shí)的恢復(fù)可看到明顯的肝臟再生現(xiàn)象。證明所建立的lfabp:Dendra2 NTR轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)系能夠特異性損傷肝臟,撤除藥物后肝臟可以再生,能夠滿足肝臟再生正向突變篩選的要求。 通過(guò)對(duì)于斑馬魚(yú)肝臟再生細(xì)胞來(lái)源的研究,發(fā)現(xiàn)在肝臟完全損傷的情況下,再生的肝細(xì)胞來(lái)源為非肝細(xì)胞的轉(zhuǎn)化并且最早出現(xiàn)在靠近心臟附近的原肝臟位置,細(xì)胞數(shù)目也隨著恢復(fù)時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增多。已經(jīng)有研究報(bào)道心臟中胚層的Fgf信號(hào)對(duì)于起始肝臟的發(fā)育至關(guān)重要。在肝臟完全損傷的情況下,很可能一定程度上重復(fù)了肝臟的發(fā)育的起始過(guò)程,心臟附近某些特殊的非肝臟細(xì)胞在接收了心臟的誘導(dǎo)條件后,轉(zhuǎn)化形成正常的肝細(xì)胞參與肝臟的再生。
【圖文】：

圖4.1.2:含lfabP啟動(dòng)子片段的酶切M:Marker:DigestionoffragmentinvolvinglfabPPromoterM:結(jié)果證明酶切順利，通過(guò)純化得到的lfabp啟一DendraZ一NTR片斷進(jìn)行連接。雖然第二步的

4.1.1:pBlueseriptll一Ks一Ifabp的酶切M:Marke4.1.1:DigestionofPBluescriPt11一KS一lfabPM:MarkM
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R-332

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 ;Liver development in zebrafish (Danio rerio)[J];遺傳學(xué)報(bào);2009年06期

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本文編號(hào)：2572839