【摘要】： B細(xì)胞激活因子(B cell activating factor belonging to the TNF family, BAFF),又稱為B淋巴細(xì)胞刺激因子(B lymphocyte stimulator, BLyS)是TNF家族成員之一。它可特異性的刺激B淋巴細(xì)胞增殖、分化和分泌抗體,對(duì)B細(xì)胞的存活、發(fā)育、分化起到重要的調(diào)控作用。BAFF可與三種受體:BCMA、TACI和BAFF-R結(jié)合,通過(guò)激活NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑增強(qiáng)B細(xì)胞的抗凋亡能力。BAFF的過(guò)表達(dá)與系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)及干燥綜合征(SS)等許多自身免疫性疾病及B細(xì)胞腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有著密切關(guān)系。 由于受體與BAFF具有高親和力,可特異性識(shí)別BAFF并與之結(jié)合,因此體外構(gòu)建表達(dá)的BAFF受體胞外段融合蛋白可中和體內(nèi)過(guò)表達(dá)的BAFF,控制B細(xì)胞的增殖和活化,緩解和治療與BAFF相關(guān)的自身免疫病和B細(xì)胞腫瘤。本課題的研究為開(kāi)發(fā)BAFF拮抗劑治療BAFF相關(guān)疾病提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 本課題研究方法:對(duì)BAFF及其受體融合蛋白原核重組表達(dá)載體進(jìn)行鑒定,表達(dá)受體和配體蛋白并對(duì)其進(jìn)行純化,在體外研究受體與配體相互作用,并在細(xì)胞水平鑒定受體中和配體功能的活性。 主要研究結(jié)果: (一)BAFF及其受體融合蛋白原核重組表達(dá)載體的鑒定:本實(shí)驗(yàn)室已將釣取的BAFF及其受體基因片段連接到原核表達(dá)載體pET-32a或pGEX6p-1上,對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定、酶切鑒定和DNA測(cè)序鑒定,證明表達(dá)載體構(gòu)建正確。 (二)BAFF及其受體融合蛋白的表達(dá)與純化:重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta(DE3)、JM109等。在IPTG誘導(dǎo)下,使基因在工程菌中表達(dá),經(jīng)SDS-PAGE鑒定。融合蛋白分別利用鎳金屬螯合瓊脂糖凝膠親和層析柱和谷胱甘肽-瓊脂糖珠混懸液純化,經(jīng)濃縮和濃度測(cè)定后分裝凍干保存。 (三)BAFF受體融合蛋白的活性鑒定:首先通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)了BAFF與受體融合蛋白在體外結(jié)合情況。然后在體外建立的BAFF刺激小鼠脾細(xì)胞增殖模型中,觀察到融合蛋白對(duì)BAFF的活性有一定得拮抗作用,并呈現(xiàn)時(shí)間和劑量依賴性。
【圖文】：

第一章 文獻(xiàn)綜述1.2 BAFF 受體1.2.1 概述BAFF 可與三種受體[20]：B 細(xì)胞成熟抗原(B cell maturation antigen, BCMA[21]，跨膜激活物和 CAML 結(jié)合物(Transmembrane activator and CAML-interactoTACI)[22]和 BAFF 受體（BAFF receptor, BAFF-R）[23]結(jié)合。三個(gè)受體均含有與配體相結(jié)合的半胱氨酸富集區(qū)，但不含死亡區(qū)域的功能區(qū)，，因而與 BAFF 結(jié)合后不能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而可通過(guò)激活 NF-κ B 促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和成熟[24]。其中 BR3 只特異于 BAFF 結(jié)合，是三個(gè)受體中親和力最強(qiáng)的一個(gè)[25,26]。BCMA 和 TACI 不僅能與 BAFF 相結(jié)合，也能夠與 TNF 配體家族的另一個(gè)成員增殖誘導(dǎo)配體 APRIL (a proliferation-inducing)相結(jié)合。APRIL 對(duì)淋巴、結(jié)腸及甲狀腺系統(tǒng)的腫瘤細(xì)胞有刺激其生長(zhǎng)的作用[27]。

定載體是否進(jìn)入細(xì)胞；可控轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子，經(jīng)誘導(dǎo)后從克隆化基NA；轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列；一個(gè)多限制酶位點(diǎn)接頭，以便外緣基因驗(yàn)室已將從Daudi細(xì)胞系cDNA文庫(kù)中克隆的BAFF及其受體2a、pGEX6p-1 等原核表達(dá)載體中，構(gòu)建成為重組元和表達(dá)載體基礎(chǔ)上對(duì)重組表達(dá)載體進(jìn)行了 PCR、酶切和測(cè)序鑒定，以證確。與儀器料宿主菌：oli. JM109；E. Coli. BL21；E. Coli. Rosetta（DE3）載體：32a：
【學(xué)位授予單位】：天津大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號(hào)】：R363

【引證文獻(xiàn)】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 楊潔;富含脯氨酸的酪氨酸激酶在系統(tǒng)性紅斑狼瘡淋巴細(xì)胞中的表達(dá)及意義[D];山西醫(yī)科大學(xué);2012年

本文編號(hào)：2570384