【摘要】： 目的骨髓間充質(zhì)干細胞(Bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)是骨髓中除造血干細胞外另一類具有自我復制能力和多向分化潛能的成體干細胞。在不同的條件下可以誘導分化為成骨細胞、成纖維細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、肌肉細胞、內(nèi)皮細胞及神經(jīng)細胞等。另外,骨髓間充質(zhì)干細胞具有取材方便,對機體損傷小,體外培養(yǎng)增殖能力強等優(yōu)點,選用自體骨髓間充質(zhì)干細胞進行組織再生或移植,不僅沒有移植排異反應,還避免了倫理紛爭。因此骨髓間充質(zhì)干細胞被認為是最有前途的組織工程種子細胞。 誘導骨髓間充質(zhì)干細胞向神經(jīng)系統(tǒng)組成細胞分化是目前研究的熱點,而BMSCs的準確誘導定向分化是其用于臨床治療的基礎,這就需要對BMSCs有關的信號調(diào)節(jié)、微環(huán)境作用進行深入研究。目前研究發(fā)現(xiàn)BMSCs向神經(jīng)樣細胞誘導分化大致上可分為四種途徑:細胞生長因子為基礎的誘導、提高胞內(nèi)cAMP為基礎的方式誘導、抗氧化劑為基礎的誘導、神經(jīng)細胞培養(yǎng)上清液為基礎的誘導。 Rac1是小G蛋白Rho家族的成員之一,在細胞中以有活性的GTP形式與無活性的GDP形式存在,參與細胞骨架重組、基因轉錄調(diào)控和細胞信號轉導等生理過程,影響細胞的極性與形態(tài)、粘附與遷移、增殖與分化等細胞事件。研究證實,在神經(jīng)細胞發(fā)育過程中Rac1、Cdc42、RhoA參與了軸突與樹突的形成。 本實驗以BMSCs向神經(jīng)樣細胞分化過程中Rac1蛋白及其活性形式表達變化為研究內(nèi)容,旨在探討Rac1與BMSCs向神經(jīng)樣細胞分化過程的關系。 方法采用Percoll法分離大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞、通過傳代得到純化的BMSCs,并對細胞進行表型檢測及成骨、成脂肪分化能力鑒定。取第5代的骨髓間充質(zhì)干細胞,分別應用丁羥基茴香醚(BHA)、堿性成纖維生長因子(bFGF)聯(lián)合誘導劑和全反式維甲酸(RA)、β-巰基乙醇(β-ME)聯(lián)合誘導劑誘導細胞。對誘導細胞進行形態(tài)觀察和免疫熒光染色檢測神經(jīng)細胞標志物。綜合比較兩種誘導方法的效果,從中選擇最適合的一種作為研究Rac1與BMSCs向神經(jīng)樣細胞過程關系的實驗方法。 根據(jù)BMSCs向神經(jīng)樣細胞分化過程的特點,設立A-J十個實驗檢測點:細胞接種后24 h達到50%匯合為A點,接種后換成含bFGF的預誘導液培養(yǎng)24 h為B點,預誘導后換成含BHA的誘導劑誘導5 h為C點,誘導后用含N2的神經(jīng)細胞維持培養(yǎng)基培養(yǎng)18 h為D點、維持培養(yǎng)長達48 h為E點,預誘導24 h后換回BMSCs常規(guī)培養(yǎng)基返回培養(yǎng)24 h為F點,誘導5 h后換回BMSCs常規(guī)培養(yǎng)基返回培養(yǎng)18 h為G點、返回培養(yǎng)后再次預誘導24 h為H點、再次誘導5 h為I點,用神經(jīng)細胞維持培養(yǎng)基維持培養(yǎng)18 h后換回BMSCs常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h為J點。 采用免疫熒光染色檢測相關細胞表型在實驗過程中的表達情況,免疫印跡(Western blot)結合免疫沉降(Pull-down)的方法測定各實驗檢測點Rac1、Cdc42、RhoA蛋白及其活性形式的表達變化情況。 結果免疫熒光染色檢測顯示體外培養(yǎng)的細胞表達間質(zhì)細胞表面抗原CD29、CD90、CD106、CD71,而不表達造血細胞特異性抗原CD34、CD45,證明了所培養(yǎng)的細胞是BMSCs。組織化學染色顯示BMSCs成骨、成脂肪誘導分化的細胞分別呈現(xiàn)堿性磷酸酶染色陽性和油紅O染色陽性,進一步鑒定了用于實驗的細胞是具有多向分化潛能的BMSCs。 對BMSCs向神經(jīng)樣細胞分化過程中神經(jīng)細胞標志物的免疫熒光染色檢測結果顯示,BHA、bFGF聯(lián)合誘導劑和RA、β-ME聯(lián)合誘導劑均能誘導BMSCs分化為表達神經(jīng)細胞標志物nestin、β-tubulin和成熟神經(jīng)元標志物NSE的神經(jīng)樣細胞,而兩種方法分化的細胞均不表達星形膠質(zhì)細胞標志物GFAP,BHA、bFGF聯(lián)合誘導組和RA、β-ME聯(lián)合誘導組誘導的細胞表達成熟神經(jīng)元NSE的陽性率分別為80.05%和71.61%,兩者相比無統(tǒng)計學差異。 采用BHA、bFGF聯(lián)合誘導劑誘導BMSCs向神經(jīng)樣細胞分化過程中,誘導5 h后細胞的Rac1蛋白表達水平與誘導前相比顯著降低,誘導后用神經(jīng)細胞維持培養(yǎng)基培養(yǎng)18 h、維持培養(yǎng)48 h與誘導前相比也顯著下降。誘導5 h的細胞用BMSCs常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)后,細胞返回BMSCs的形態(tài),且Rac1蛋白表達水平比誘導后的細胞顯著上升,對該返回BMSCs形態(tài)的細胞再次誘導,Rac1蛋白表達水平仍然表現(xiàn)出誘導后比誘導前顯著下降的情況。然而,我們對誘導后的細胞用神經(jīng)細胞維持培養(yǎng)基培養(yǎng)18 h后再換回BMSCs常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng),細胞不能返回BMSCs的形態(tài),且Rac1蛋白表達仍然維持在一個較低的水平。BMSCs向神經(jīng)樣細胞分化過程中,Cdc42、RhoA的蛋白表達變化趨勢與Rac1一致。蛋白活性檢測顯示Rac1-GTP活性蛋白表達在BMSCs向神經(jīng)樣細胞分化過程中上升,Cdc42-GTP活性蛋白與Rac1-GTP變化一致,而RhoA-GTP則下降。 免疫印跡實驗結果顯示,Rac1、Cdc42、RhoA蛋白表達水平在BMSCs向神經(jīng)樣細胞分化過程中顯著降低;Rac1、Cdc42活性蛋白含量上升,而RhoA活性蛋白含量下降。 結論骨髓間充質(zhì)干細胞可在體外分離培養(yǎng)并穩(wěn)定擴增傳代至30代而未發(fā)生老化。BMSCs能夠定向分化成骨、脂肪細胞及具有神經(jīng)細胞表型的神經(jīng)樣細胞。Rac1及其相關蛋白Cdc42、RhoA的蛋白表達及活性與BMSCs向神經(jīng)樣細胞分化過程相關,為調(diào)控BMSCs定向分化為神經(jīng)系統(tǒng)組成細胞提供了一定的實驗依據(jù)。
【圖文】：

21圖 1-1 相差顯微鏡觀察各代細胞形態(tài)。（A）原代培養(yǎng)培養(yǎng) 3-4 天，貼壁細胞變?yōu)殚L梭形，聚集成團，形成克隆；（B）原代培養(yǎng) 10 天后細胞接近匯合，呈長梭形排列，并匯合成漩渦狀；（C）10 代細胞保持長梭形形態(tài)生長；（D）30 代細胞保持成纖維細胞樣形態(tài)呈漩渦狀生長。Scale bar=100μm。2 免疫熒光染色鑒定細胞表型免疫熒光染色結果顯示：所測細胞呈現(xiàn) CD29、71、90、106 表面抗原陽性（圖1-2），而造血細胞特異抗原 CD34、CD45 陰性（圖中未示）。

圖 1-2 BMSCs 的表型鑒定。（A、B）CD90 陽性；（C、D）CD29 陽性；（E、F）CD106 陽性；（G、H）CD71 陽性。Scale bar=50 μm。3 成骨、成脂肪分化能力鑒定成骨誘導后細胞長至匯合，由長梭形變?yōu)槎嘟切�，并且呈現(xiàn)鋪路卵石樣排列（圖1-3A），隨著誘導時間的延長，局部細胞呈重疊生長，基質(zhì)逐漸堆積、基質(zhì)中礦鹽沉積，形成多個結節(jié)，并逐漸融合。堿性磷酸酶染色顯示成骨誘導 21 天時多數(shù)細胞呈陽性反應，即胞漿中出現(xiàn)淺棕色至棕黑色的細胞顆粒，，可見到被染成深棕黑的融合成片狀的陽性細胞（圖 1-3B）。非誘導對照組經(jīng)鈣鈷法染色后，大部分細胞呈現(xiàn)伊紅復染后的粉紅色，偶見少數(shù)細胞呈現(xiàn)淺棕色，細胞仍呈長梭形生長，未見片狀強陽性細胞（結果未示）。成脂肪誘導 6 天，部分細胞胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)散在小脂滴，主要分布細胞核周圍。隨著培養(yǎng)時間延長，出現(xiàn)脂滴的細胞增多，培養(yǎng) 9 天時可見細胞質(zhì)內(nèi)充滿大小均一的脂滴。繼續(xù)誘導后，可見胞質(zhì)內(nèi)的脂滴逐漸融合成大脂滴，細胞體積增大，
【學位授予單位】：蘇州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2008
【分類號】：R329

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本文編號：2570338