【摘要】： 目的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)是骨髓中除造血干細(xì)胞外另一類具有自我復(fù)制能力和多向分化潛能的成體干細(xì)胞。在不同的條件下可以誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞及神經(jīng)細(xì)胞等。另外,骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有取材方便,對機(jī)體損傷小,體外培養(yǎng)增殖能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn),選用自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行組織再生或移植,不僅沒有移植排異反應(yīng),還避免了倫理紛爭。因此骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞被認(rèn)為是最有前途的組織工程種子細(xì)胞。 誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)系統(tǒng)組成細(xì)胞分化是目前研究的熱點(diǎn),而BMSCs的準(zhǔn)確誘導(dǎo)定向分化是其用于臨床治療的基礎(chǔ),這就需要對BMSCs有關(guān)的信號調(diào)節(jié)、微環(huán)境作用進(jìn)行深入研究。目前研究發(fā)現(xiàn)BMSCs向神經(jīng)樣細(xì)胞誘導(dǎo)分化大致上可分為四種途徑:細(xì)胞生長因子為基礎(chǔ)的誘導(dǎo)、提高胞內(nèi)cAMP為基礎(chǔ)的方式誘導(dǎo)、抗氧化劑為基礎(chǔ)的誘導(dǎo)、神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)上清液為基礎(chǔ)的誘導(dǎo)。 Rac1是小G蛋白Rho家族的成員之一,在細(xì)胞中以有活性的GTP形式與無活性的GDP形式存在,參與細(xì)胞骨架重組、基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控和細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等生理過程,影響細(xì)胞的極性與形態(tài)、粘附與遷移、增殖與分化等細(xì)胞事件。研究證實(shí),在神經(jīng)細(xì)胞發(fā)育過程中Rac1、Cdc42、RhoA參與了軸突與樹突的形成。 本實(shí)驗(yàn)以BMSCs向神經(jīng)樣細(xì)胞分化過程中Rac1蛋白及其活性形式表達(dá)變化為研究內(nèi)容,旨在探討Rac1與BMSCs向神經(jīng)樣細(xì)胞分化過程的關(guān)系。 方法采用Percoll法分離大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、通過傳代得到純化的BMSCs,并對細(xì)胞進(jìn)行表型檢測及成骨、成脂肪分化能力鑒定。取第5代的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,分別應(yīng)用丁羥基茴香醚(BHA)、堿性成纖維生長因子(bFGF)聯(lián)合誘導(dǎo)劑和全反式維甲酸(RA)、β-巰基乙醇(β-ME)聯(lián)合誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)細(xì)胞。對誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)觀察和免疫熒光染色檢測神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)志物。綜合比較兩種誘導(dǎo)方法的效果,從中選擇最適合的一種作為研究Rac1與BMSCs向神經(jīng)樣細(xì)胞過程關(guān)系的實(shí)驗(yàn)方法。 根據(jù)BMSCs向神經(jīng)樣細(xì)胞分化過程的特點(diǎn),設(shè)立A-J十個(gè)實(shí)驗(yàn)檢測點(diǎn):細(xì)胞接種后24 h達(dá)到50%匯合為A點(diǎn),接種后換成含bFGF的預(yù)誘導(dǎo)液培養(yǎng)24 h為B點(diǎn),預(yù)誘導(dǎo)后換成含BHA的誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)5 h為C點(diǎn),誘導(dǎo)后用含N2的神經(jīng)細(xì)胞維持培養(yǎng)基培養(yǎng)18 h為D點(diǎn)、維持培養(yǎng)長達(dá)48 h為E點(diǎn),預(yù)誘導(dǎo)24 h后換回BMSCs常規(guī)培養(yǎng)基返回培養(yǎng)24 h為F點(diǎn),誘導(dǎo)5 h后換回BMSCs常規(guī)培養(yǎng)基返回培養(yǎng)18 h為G點(diǎn)、返回培養(yǎng)后再次預(yù)誘導(dǎo)24 h為H點(diǎn)、再次誘導(dǎo)5 h為I點(diǎn),用神經(jīng)細(xì)胞維持培養(yǎng)基維持培養(yǎng)18 h后換回BMSCs常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h為J點(diǎn)。 采用免疫熒光染色檢測相關(guān)細(xì)胞表型在實(shí)驗(yàn)過程中的表達(dá)情況,免疫印跡(Western blot)結(jié)合免疫沉降(Pull-down)的方法測定各實(shí)驗(yàn)檢測點(diǎn)Rac1、Cdc42、RhoA蛋白及其活性形式的表達(dá)變化情況。 結(jié)果免疫熒光染色檢測顯示體外培養(yǎng)的細(xì)胞表達(dá)間質(zhì)細(xì)胞表面抗原CD29、CD90、CD106、CD71,而不表達(dá)造血細(xì)胞特異性抗原CD34、CD45,證明了所培養(yǎng)的細(xì)胞是BMSCs。組織化學(xué)染色顯示BMSCs成骨、成脂肪誘導(dǎo)分化的細(xì)胞分別呈現(xiàn)堿性磷酸酶染色陽性和油紅O染色陽性,進(jìn)一步鑒定了用于實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞是具有多向分化潛能的BMSCs。 對BMSCs向神經(jīng)樣細(xì)胞分化過程中神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)志物的免疫熒光染色檢測結(jié)果顯示,BHA、bFGF聯(lián)合誘導(dǎo)劑和RA、β-ME聯(lián)合誘導(dǎo)劑均能誘導(dǎo)BMSCs分化為表達(dá)神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)志物nestin、β-tubulin和成熟神經(jīng)元標(biāo)志物NSE的神經(jīng)樣細(xì)胞,而兩種方法分化的細(xì)胞均不表達(dá)星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物GFAP,BHA、bFGF聯(lián)合誘導(dǎo)組和RA、β-ME聯(lián)合誘導(dǎo)組誘導(dǎo)的細(xì)胞表達(dá)成熟神經(jīng)元NSE的陽性率分別為80.05%和71.61%,兩者相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 采用BHA、bFGF聯(lián)合誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)BMSCs向神經(jīng)樣細(xì)胞分化過程中,誘導(dǎo)5 h后細(xì)胞的Rac1蛋白表達(dá)水平與誘導(dǎo)前相比顯著降低,誘導(dǎo)后用神經(jīng)細(xì)胞維持培養(yǎng)基培養(yǎng)18 h、維持培養(yǎng)48 h與誘導(dǎo)前相比也顯著下降。誘導(dǎo)5 h的細(xì)胞用BMSCs常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)后,細(xì)胞返回BMSCs的形態(tài),且Rac1蛋白表達(dá)水平比誘導(dǎo)后的細(xì)胞顯著上升,對該返回BMSCs形態(tài)的細(xì)胞再次誘導(dǎo),Rac1蛋白表達(dá)水平仍然表現(xiàn)出誘導(dǎo)后比誘導(dǎo)前顯著下降的情況。然而,我們對誘導(dǎo)后的細(xì)胞用神經(jīng)細(xì)胞維持培養(yǎng)基培養(yǎng)18 h后再換回BMSCs常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng),細(xì)胞不能返回BMSCs的形態(tài),且Rac1蛋白表達(dá)仍然維持在一個(gè)較低的水平。BMSCs向神經(jīng)樣細(xì)胞分化過程中,Cdc42、RhoA的蛋白表達(dá)變化趨勢與Rac1一致。蛋白活性檢測顯示Rac1-GTP活性蛋白表達(dá)在BMSCs向神經(jīng)樣細(xì)胞分化過程中上升,Cdc42-GTP活性蛋白與Rac1-GTP變化一致,而RhoA-GTP則下降。 免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,Rac1、Cdc42、RhoA蛋白表達(dá)水平在BMSCs向神經(jīng)樣細(xì)胞分化過程中顯著降低;Rac1、Cdc42活性蛋白含量上升,而RhoA活性蛋白含量下降。 結(jié)論骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可在體外分離培養(yǎng)并穩(wěn)定擴(kuò)增傳代至30代而未發(fā)生老化。BMSCs能夠定向分化成骨、脂肪細(xì)胞及具有神經(jīng)細(xì)胞表型的神經(jīng)樣細(xì)胞。Rac1及其相關(guān)蛋白Cdc42、RhoA的蛋白表達(dá)及活性與BMSCs向神經(jīng)樣細(xì)胞分化過程相關(guān),為調(diào)控BMSCs定向分化為神經(jīng)系統(tǒng)組成細(xì)胞提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
【圖文】：

21圖 1-1 相差顯微鏡觀察各代細(xì)胞形態(tài)。（A）原代培養(yǎng)培養(yǎng) 3-4 天，貼壁細(xì)胞變?yōu)殚L梭形，聚集成團(tuán)，形成克�。唬˙）原代培養(yǎng) 10 天后細(xì)胞接近匯合，呈長梭形排列，并匯合成漩渦狀；（C）10 代細(xì)胞保持長梭形形態(tài)生長；（D）30 代細(xì)胞保持成纖維細(xì)胞樣形態(tài)呈漩渦狀生長。Scale bar=100μm。2 免疫熒光染色鑒定細(xì)胞表型免疫熒光染色結(jié)果顯示：所測細(xì)胞呈現(xiàn) CD29、71、90、106 表面抗原陽性（圖1-2），而造血細(xì)胞特異抗原 CD34、CD45 陰性（圖中未示）。

圖 1-2 BMSCs 的表型鑒定。（A、B）CD90 陽性；（C、D）CD29 陽性；（E、F）CD106 陽性；（G、H）CD71 陽性。Scale bar=50 μm。3 成骨、成脂肪分化能力鑒定成骨誘導(dǎo)后細(xì)胞長至匯合，由長梭形變?yōu)槎嘟切�，并且呈現(xiàn)鋪路卵石樣排列（圖1-3A），隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長，局部細(xì)胞呈重疊生長，基質(zhì)逐漸堆積、基質(zhì)中礦鹽沉積，形成多個(gè)結(jié)節(jié)，并逐漸融合。堿性磷酸酶染色顯示成骨誘導(dǎo) 21 天時(shí)多數(shù)細(xì)胞呈陽性反應(yīng)，即胞漿中出現(xiàn)淺棕色至棕黑色的細(xì)胞顆粒，，可見到被染成深棕黑的融合成片狀的陽性細(xì)胞（圖 1-3B）。非誘導(dǎo)對照組經(jīng)鈣鈷法染色后，大部分細(xì)胞呈現(xiàn)伊紅復(fù)染后的粉紅色，偶見少數(shù)細(xì)胞呈現(xiàn)淺棕色，細(xì)胞仍呈長梭形生長，未見片狀強(qiáng)陽性細(xì)胞（結(jié)果未示）。成脂肪誘導(dǎo) 6 天，部分細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)散在小脂滴，主要分布細(xì)胞核周圍。隨著培養(yǎng)時(shí)間延長，出現(xiàn)脂滴的細(xì)胞增多，培養(yǎng) 9 天時(shí)可見細(xì)胞質(zhì)內(nèi)充滿大小均一的脂滴。繼續(xù)誘導(dǎo)后，可見胞質(zhì)內(nèi)的脂滴逐漸融合成大脂滴，細(xì)胞體積增大，
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號】：R329

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本文編號：2570338