【摘要】： 第一部分TSEG-2基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá) 目的：構(gòu)建睪丸特異表達(dá)基因2 (testis specific expressed gene 2, TSEG-2)的真核表達(dá)載體,探討TSEG-2在細(xì)胞中的表達(dá)及其生物學(xué)功能。 方法：以小鼠睪丸組織cDNA為模版,設(shè)計(jì)攜帶HindⅢ和BamHⅠ酶切位點(diǎn)的引物序列,聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增基因片段,克隆至攜帶增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)的真核表達(dá)載體pEGFP-N1;在陽離子聚合物聚乙烯亞胺(PEI)的介導(dǎo)下,重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的精母細(xì)胞株GC-2spd,熒光顯微鏡下觀察TSEG-2基因在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)定位,MTT法測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)活性,AO/EB熒光染色法、Hoechst 33258熒光染色法、Annexin V-FITC/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡,JC-1染色流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)線粒體膜電位,實(shí)時(shí)定量PCR測(cè)定Fas、Bcl-2、Bax表達(dá)水平。 結(jié)果：.成功構(gòu)建了TSEG-2與EGFP的融合表達(dá)載體pEGFP-TSEG2,轉(zhuǎn)染GC-2spd細(xì)胞后可見胞漿內(nèi)綠色熒光蛋白表達(dá)。轉(zhuǎn)染pEGFP-TSEG2 48h后,GC-2spd細(xì)胞生長(zhǎng)抑制39.2%(P0.05),出現(xiàn)細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)改變,凋亡率為28.3%(P0.05)；線粒體膜電位顯著低于對(duì)照組(P0.05), GC-2spd細(xì)胞中Fas和Bcl-2的表達(dá)下調(diào),而Bax的表達(dá)上調(diào)。 結(jié)論：成功構(gòu)建TSEG-2基因的真核表達(dá)載體,在精母細(xì)胞株中表達(dá)并促進(jìn)細(xì)胞凋亡,并提示TEGS-2可能通過內(nèi)源性凋亡途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。為進(jìn)一步在細(xì)胞和動(dòng)物水平開展TSEG-2功能研究奠定了基礎(chǔ)。 第二部分TSEG-2基因在小鼠睪丸扭轉(zhuǎn)復(fù)位模型中的表達(dá)特征 目的探討睪丸特異表達(dá)基因2(testis specific expressed gene 2,TSEG-2)在小鼠睪丸扭轉(zhuǎn)復(fù)位模型中的表達(dá)特征。 方法昆明小鼠36只,隨機(jī)分組為對(duì)照組(6只)、假手術(shù)組(6只)、單側(cè)睪丸扭轉(zhuǎn)復(fù)位實(shí)驗(yàn)組(24只)。實(shí)驗(yàn)組分為2組,每組12只,左側(cè)睪丸扭轉(zhuǎn)720度維持2 h,分別于復(fù)位后1、7天取扭轉(zhuǎn)側(cè)睪丸。采用HE染色、原位末端標(biāo)記技術(shù)(TUNEL)觀察睪丸組織形態(tài)改變；黃嘌呤氧化酶法、硫代巴比妥酸比色法測(cè)定超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)活性；原位雜交法觀測(cè)TSEG-2在睪丸生精細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)定位；實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)TSEG-2基因在睪丸組織中的表達(dá)水平。 結(jié)果對(duì)照組和假手術(shù)組生精上皮排列規(guī)則,扭轉(zhuǎn)復(fù)位后1、7天的睪丸組織內(nèi)生精上皮結(jié)構(gòu)松散,出現(xiàn)生精細(xì)胞凋亡,Johnsen's評(píng)分分別降低23.4％、64.1％(P0.01),SOD活性降低11.6％、22.2％(P0.05),MDA活性升高69.6％、93.2％(P0.01)。TSEG-2基因表達(dá)定位于小鼠睪丸生精小管的精原細(xì)胞和精母細(xì)胞。與對(duì)照組比較,扭轉(zhuǎn)復(fù)位1、7天后睪丸組織內(nèi)TSEG-2表達(dá)水平分別上調(diào)2.2倍、6.6倍(P0.01) 結(jié)論成功建立小鼠睪丸扭轉(zhuǎn)復(fù)位模型,TSEG-2表達(dá)上調(diào)可能與抗氧化酶活性下降、生精細(xì)胞凋亡有關(guān)。 第三部分睪丸特異性基因TSEG-2在隱睪模型中的表達(dá)及其在生精細(xì)胞凋亡中的作用 目的進(jìn)一步探討睪丸特異表達(dá)基因2(testis specific expressed gene 2,TSEG-2)的功能及其在隱睪模型中的表達(dá)特點(diǎn)。 方法35只BALB/C小鼠(8周齡)隨機(jī)分組為單側(cè)手術(shù)隱睪組(20只)、假手術(shù)組(10只)、空白對(duì)照組(5只)。在手術(shù)隱睪組中,將右側(cè)睪丸固定于腹壁內(nèi)側(cè)。real-timePCR法檢測(cè)TSEG-2基因在隱睪模型中的表達(dá)特點(diǎn)。在聚乙烯亞胺(PEI)的介導(dǎo)下,采用睪丸內(nèi)注射方法,將重組載體pEGFP-TSEG-2(n=5)和空載體(n=5)轉(zhuǎn)染至正常雄性小鼠睪丸,熒光顯微鏡觀測(cè)轉(zhuǎn)染效率,TUNEL法檢測(cè)生精細(xì)胞凋亡。 結(jié)果原位雜交顯示TSEG-2 mRNA表達(dá)定位于小鼠睪丸生精小管的精原細(xì)胞和精母細(xì)胞。與假手術(shù)組和對(duì)照組比較,隱睪組睪丸組織內(nèi)TSEG-2表達(dá)顯著上調(diào)(P0.05),生精細(xì)胞凋亡比例增高(P0.05)。PEI能有效介導(dǎo)TSEG-2轉(zhuǎn)染至曲精小管,轉(zhuǎn)染1周后生精細(xì)胞凋亡顯著增多(P0.05)。 結(jié)論這些結(jié)果提示TSEG-2可能參與了生精細(xì)胞的凋亡和隱睪的病理過程。
【圖文】：

華中科技大學(xué)博士學(xué)位論文PEGFP圖1一Nl轉(zhuǎn)染組pEGFp一NI一TSEGZ轉(zhuǎn)染組熒光顯微鏡觀察pEGFP一TSEGZ在GC一ZsPd細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)者1卜={歪。·，，{里__… 0)U.七}0{山{名 0.4}里}澄{一 0.2卜對(duì)照組PE(玉FP一 N1TSE(玉一2圖2轉(zhuǎn)染7’S，‘G一2基因?qū)C一ZsPd細(xì)胞生長(zhǎng)活性的抑制作用32

轉(zhuǎn)染7’S，‘G一2基因?qū)C一ZsPd細(xì)胞生長(zhǎng)活性的抑制作用
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R341

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2568450