【摘要】： 第一部分TSEG-2基因真核表達載體的構建及其在細胞內的表達 目的：構建睪丸特異表達基因2 (testis specific expressed gene 2, TSEG-2)的真核表達載體,探討TSEG-2在細胞中的表達及其生物學功能。 方法：以小鼠睪丸組織cDNA為模版,設計攜帶HindⅢ和BamHⅠ酶切位點的引物序列,聚合酶鏈反應擴增基因片段,克隆至攜帶增強型綠色熒光蛋白(EGFP)的真核表達載體pEGFP-N1;在陽離子聚合物聚乙烯亞胺(PEI)的介導下,重組質粒轉染體外培養(yǎng)的精母細胞株GC-2spd,熒光顯微鏡下觀察TSEG-2基因在細胞內的表達定位,MTT法測定細胞生長活性,AO/EB熒光染色法、Hoechst 33258熒光染色法、Annexin V-FITC/PI雙染流式細胞術檢測細胞凋亡,JC-1染色流式細胞術檢測線粒體膜電位,實時定量PCR測定Fas、Bcl-2、Bax表達水平。 結果：.成功構建了TSEG-2與EGFP的融合表達載體pEGFP-TSEG2,轉染GC-2spd細胞后可見胞漿內綠色熒光蛋白表達。轉染pEGFP-TSEG2 48h后,GC-2spd細胞生長抑制39.2%(P0.05),出現(xiàn)細胞凋亡形態(tài)學改變,凋亡率為28.3%(P0.05)；線粒體膜電位顯著低于對照組(P0.05), GC-2spd細胞中Fas和Bcl-2的表達下調,而Bax的表達上調。 結論：成功構建TSEG-2基因的真核表達載體,在精母細胞株中表達并促進細胞凋亡,并提示TEGS-2可能通過內源性凋亡途徑誘導細胞凋亡。為進一步在細胞和動物水平開展TSEG-2功能研究奠定了基礎。 第二部分TSEG-2基因在小鼠睪丸扭轉復位模型中的表達特征 目的探討睪丸特異表達基因2(testis specific expressed gene 2,TSEG-2)在小鼠睪丸扭轉復位模型中的表達特征。 方法昆明小鼠36只,隨機分組為對照組(6只)、假手術組(6只)、單側睪丸扭轉復位實驗組(24只)。實驗組分為2組,每組12只,左側睪丸扭轉720度維持2 h,分別于復位后1、7天取扭轉側睪丸。采用HE染色、原位末端標記技術(TUNEL)觀察睪丸組織形態(tài)改變；黃嘌呤氧化酶法、硫代巴比妥酸比色法測定超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)活性；原位雜交法觀測TSEG-2在睪丸生精細胞內的表達定位；實時定量PCR法檢測TSEG-2基因在睪丸組織中的表達水平。 結果對照組和假手術組生精上皮排列規(guī)則,扭轉復位后1、7天的睪丸組織內生精上皮結構松散,出現(xiàn)生精細胞凋亡,Johnsen's評分分別降低23.4％、64.1％(P0.01),SOD活性降低11.6％、22.2％(P0.05),MDA活性升高69.6％、93.2％(P0.01)。TSEG-2基因表達定位于小鼠睪丸生精小管的精原細胞和精母細胞。與對照組比較,扭轉復位1、7天后睪丸組織內TSEG-2表達水平分別上調2.2倍、6.6倍(P0.01) 結論成功建立小鼠睪丸扭轉復位模型,TSEG-2表達上調可能與抗氧化酶活性下降、生精細胞凋亡有關。 第三部分睪丸特異性基因TSEG-2在隱睪模型中的表達及其在生精細胞凋亡中的作用 目的進一步探討睪丸特異表達基因2(testis specific expressed gene 2,TSEG-2)的功能及其在隱睪模型中的表達特點。 方法35只BALB/C小鼠(8周齡)隨機分組為單側手術隱睪組(20只)、假手術組(10只)、空白對照組(5只)。在手術隱睪組中,將右側睪丸固定于腹壁內側。real-timePCR法檢測TSEG-2基因在隱睪模型中的表達特點。在聚乙烯亞胺(PEI)的介導下,采用睪丸內注射方法,將重組載體pEGFP-TSEG-2(n=5)和空載體(n=5)轉染至正常雄性小鼠睪丸,熒光顯微鏡觀測轉染效率,TUNEL法檢測生精細胞凋亡。 結果原位雜交顯示TSEG-2 mRNA表達定位于小鼠睪丸生精小管的精原細胞和精母細胞。與假手術組和對照組比較,隱睪組睪丸組織內TSEG-2表達顯著上調(P0.05),生精細胞凋亡比例增高(P0.05)。PEI能有效介導TSEG-2轉染至曲精小管,轉染1周后生精細胞凋亡顯著增多(P0.05)。 結論這些結果提示TSEG-2可能參與了生精細胞的凋亡和隱睪的病理過程。
【圖文】：

華中科技大學博士學位論文PEGFP圖1一Nl轉染組pEGFp一NI一TSEGZ轉染組熒光顯微鏡觀察pEGFP一TSEGZ在GC一ZsPd細胞內的表達者1卜={歪。·，，{里__… 0)U.七}0{山{名 0.4}里}澄{一 0.2卜對照組PE(玉FP一 N1TSE(玉一2圖2轉染7’S，‘G一2基因對GC一ZsPd細胞生長活性的抑制作用32

轉染7’S，‘G一2基因對GC一ZsPd細胞生長活性的抑制作用
【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R341

【參考文獻】

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1 陳道楨;薛文群;龔健;詹惠英;湯月萍;吳高雄;王家俊;;PEI-氧化鐵磁性納米顆粒作為基因載體的實驗觀察[J];第四軍醫(yī)大學學報;2008年01期

2 王智宇;童強松;曾甫清;劉媛;顧朝輝;鄭麗端;蔡嘉斌;蔣國松;;小鼠睪丸新基因TSEG-2的克隆及表達分析[J];中華男科學雜志;2009年02期

3 ;Expression of a novel bHLH-Zip gene in human testis[J];Asian Journal of Andrology;2003年02期

4 ;Gene functional research using polyethylenimine-mediated in vivo gene transfection into mouse spermatogenic cells[J];Asian Journal of Andrology;2006年01期

5 孫杰;劉國華;趙海騰;;別嘌呤醇對睪丸扭轉的治療作用[J];中華小兒外科雜志;2006年06期

6 來利華;姜啟英;陳丹;虎義平;余海;王青青;湯谷平;;TAT短肽修飾的聚乙烯亞胺-β-環(huán)糊精基因載體[J];浙江大學學報(醫(yī)學版);2009年01期

本文編號：2568450