【摘要】：目的:研究環(huán)孢素A完全抗原的合成及單克隆抗體制備的方法。 方法:室溫?cái)嚢钘l件下,在脫水劑1-乙基-(3-二甲丙胺基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDCI)的作用下,將環(huán)孢素A與4-苯甲酰苯甲酸的共軛物(CsA-BBa)與聚L-賴氨酸(PL)按質(zhì)量比為3.4:1的比例進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)產(chǎn)物用截留量1萬(wàn)的透析膜透析分離、純化。在190-300nm范圍內(nèi)對(duì)合成抗原進(jìn)行紫外圖譜掃描鑒定;用5μg/ml的抗原包被酶標(biāo)板,酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)進(jìn)行抗原特異性鑒定。用完全抗原免疫七周齡雌性BALB/C小鼠, ELISA法檢測(cè)免疫小鼠血清抗體效價(jià)。在50%聚乙二醇(PEG)的作用下,將高效價(jià)小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合(脾細(xì)胞:骨髓瘤細(xì)胞=10:1)并接種于24 h前準(zhǔn)備的飼養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)板中,HAT培養(yǎng)液對(duì)融合細(xì)胞進(jìn)行選擇性培養(yǎng),用ELISA法對(duì)雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行篩選、鑒定。 結(jié)果:環(huán)孢素A完全抗原(CsA-BBa-PL)紫外吸收峰峰位209.5nm,較合成原料物質(zhì)CsA-BBa(212nm)及PL(203nm)發(fā)生了明顯遷移,證實(shí)了產(chǎn)物的生成;環(huán)孢素A完全抗原ELISA特異性檢測(cè)結(jié)果與陰性對(duì)照的比值為23.22。免疫BALB/C小鼠血清效價(jià)值為:3.35,3.43,3.37,3.31,3.38,空白對(duì)照、陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照值依次為0.080、0.42、3.43。免疫小鼠血清效價(jià)測(cè)定結(jié)果明顯大于空白對(duì)照及陰性對(duì)照值,并與陽(yáng)性對(duì)照值接近。所篩選的雜交瘤細(xì)胞能夠穩(wěn)定分泌環(huán)孢素A單克隆抗體。 結(jié)論:該實(shí)驗(yàn)方法能夠有效的合成環(huán)孢素A完全抗原;合成抗原能夠刺激BALB/C小鼠機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)并產(chǎn)生相應(yīng)環(huán)孢素A抗體;實(shí)驗(yàn)所采用雜交瘤技術(shù)能夠成功的制備環(huán)孢素A單克隆抗體。
【圖文】：

3.3.2 酶聯(lián)免疫吸附法鑒定 CsA 完全抗原酶聯(lián)免疫吸附法鑒定原理：酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）是一種以免疫反應(yīng)為基礎(chǔ)，將抗原與抗體的特異性反應(yīng)同酶對(duì)底物的高效催化作用相結(jié)合的實(shí)驗(yàn)技術(shù)[25]。酶的高效催化作用，能夠放大反應(yīng)結(jié)果，從而使測(cè)定方法達(dá)到很高的敏感度[26]。酶聯(lián)免疫吸附法的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記。①抗原或抗體與固相載體聚苯乙烯表面的疏水性部分相互吸附而結(jié)合于固相載體表面，，并保持其免疫學(xué)活性；②抗原或抗體通過(guò)共價(jià)鍵與酶連接形成酶結(jié)合物，并保持其免疫學(xué)活性和酶學(xué)活性；③酶結(jié)合物與相應(yīng)抗原或抗體結(jié)合后，加入酶催化底物，底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，根據(jù)顏色變化判斷是否存在免疫反應(yīng)，進(jìn)行定性分析。另外，顏色反應(yīng)的深淺與相應(yīng)被檢抗原或抗體的量成正相關(guān)，據(jù)此對(duì)被檢物進(jìn)行定量分析。④酶聯(lián)免疫吸附法每加入一種試劑溫育后，通過(guò)洗滌去除殘留游離反應(yīng)物，避免殘留物對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，從而保證結(jié)果的準(zhǔn)確性。主要的反應(yīng)過(guò)程見下圖 1。

圖 2 抗原抗體比例與生成沉淀物量的關(guān)系最佳包被比例確定具體操作步驟：標(biāo)板，第二孔加包被液 200μ l，其它各孔中為 100μl。 10μl 于第二孔中，然后依次倍比稀釋，終體積為 100μ l/孔置過(guò)夜。棄去孔內(nèi)液體，用 ELISA 洗滌液洗板 7 次，扣干。 BSA100μl/孔，薄膜封好，37℃ 水浴鍋中溫育，水浴鍋中 處為宜。棄去孔內(nèi)液體，按照上述同樣的方法洗板。加美國(guó)雅培公試劑盒中的 CsA 單克隆抗體 100μl /孔（ELISA 洗滌液 1浴溫育。去孔內(nèi)液體，洗板，扣干。每孔加 HRP 標(biāo)記羊抗鼠 IgG 抗：500 稀釋） 100μl，37℃ 水浴溫育。
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號(hào)】：R392

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本文編號(hào)：2563815