發(fā)布時(shí)間：2019-11-20 05:19

【摘要】：目的觀察Rho激酶在培養(yǎng)乳鼠心肌細(xì)胞缺血再灌注損傷細(xì)胞凋亡中的作用,及Rho激酶抑制劑鹽酸法舒地爾(fasudil,F)對缺血再灌注損傷細(xì)胞凋亡的影響。方法原代培養(yǎng)出生1~2 d的SD乳鼠心肌細(xì)胞,并行肌鈣蛋白抗體免疫熒光染色鑒定,建立缺血再灌注損傷(I/R)模型。實(shí)驗(yàn)分3組:①正常對照組;②I/R組;③I/R+F組:建立I/R模型前20 min加入法舒地爾,使其終濃度分別為10μmol/L(F1組)、30μmol/L(F2組)、50μmol/L(F3組)。Western blot分別檢測缺血2 h,再灌注3 h肌球蛋白磷酸酶目標(biāo)亞單位1(myosin phosphatase target subunit 1,MYPT1)磷酸化水平,作為Rho激酶功能活化的標(biāo)志。應(yīng)用流式細(xì)胞儀Annexin-V/PI雙色法檢測再灌注3、6 h時(shí)點(diǎn)心肌細(xì)胞的凋亡率。結(jié)果再灌注3 h后MYPT1的磷酸化水平明顯增加,I/R組為正常對照組的5.7倍(P0.01),F1、F2、F3組法舒地爾干預(yù)后較I/R組分別減少24.6%、40.1%、60.1%(P0.05);法舒地爾組再灌注36、h心肌細(xì)胞的凋亡率較I/R組同時(shí)間點(diǎn)顯著下降,隨給藥濃度的增加,細(xì)胞凋亡率呈下降趨勢。結(jié)論Rho激酶在缺血再灌注心肌細(xì)胞中有促凋亡作用,法舒地爾可減少缺血再灌注心肌細(xì)胞凋亡的發(fā)生,從而發(fā)揮良好的心肌保護(hù)作用。
【圖文】：

倒置相差顯微鏡下少數(shù)貼壁的單個(gè)細(xì)胞出現(xiàn)自發(fā)性搏動,細(xì)胞伸出的偽足相互接觸交織成網(wǎng),逐漸形成細(xì)胞簇或單層細(xì)胞(圖1),搏動規(guī)則而同步,頻率約80~100次/min。用肌鈣蛋白抗體行免疫熒光染色證明心肌細(xì)胞純度達(dá)90%以上,提示經(jīng)差速貼壁后獲得絕大多數(shù)為心肌細(xì)胞(圖2)。圖1　原代培養(yǎng)乳鼠心肌細(xì)胞(×200)Fig.1　Primary cultured neonatal rat cardiomyocytes(×200)圖2　乳鼠心肌細(xì)胞肌鈣蛋白免疫熒光染色(×200)Fig.2　Immunofluorescent labeling of troponin in neonatal rat car-diomyocytes(×200)2.2　Western-blot檢測Rho激酶蛋白表達(dá)　Rho激酶蛋白表達(dá)通過檢測其下游底物磷酸化MYPT1(P-MYPT1)水平。心肌細(xì)胞缺血2 h再灌注3 h后,對照組、I/R組、I/R+F1組、I/R+F2組、I/R+F3組Rho激酶蛋白表達(dá)情況見圖3,提示各組均有Rho激酶激活。Rho激酶蛋白相對表達(dá)量以Rho激酶蛋白與β-actin Western blot電泳條帶輝度比值表示。設(shè)對照組為100%,I/R組與藥物干預(yù)組為正常對照組的倍數(shù),見圖4。I/R組磷酸化MYPT1水平是正常組的5.7倍(P<0.01)

80~100次/min。用肌鈣蛋白抗體行免疫熒光染色證明心肌細(xì)胞純度達(dá)90%以上,提示經(jīng)差速貼壁后獲得絕大多數(shù)為心肌細(xì)胞(圖2)。圖1　原代培養(yǎng)乳鼠心肌細(xì)胞(×200)Fig.1　Primary cultured neonatal rat cardiomyocytes(×200)圖2　乳鼠心肌細(xì)胞肌鈣蛋白免疫熒光染色(×200)Fig.2　Immunofluorescent labeling of troponin in neonatal rat car-diomyocytes(×200)2.2　Western-blot檢測Rho激酶蛋白表達(dá)　Rho激酶蛋白表達(dá)通過檢測其下游底物磷酸化MYPT1(P-MYPT1)水平。心肌細(xì)胞缺血2 h再灌注3 h后,對照組、I/R組、I/R+F1組、I/R+F2組、I/R+F3組Rho激酶蛋白表達(dá)情況見圖3,提示各組均有Rho激酶激活。Rho激酶蛋白相對表達(dá)量以Rho激酶蛋白與β-actin Western blot電泳條帶輝度比值表示。設(shè)對照組為100%,I/R組與藥物干預(yù)組為正常對照組的倍數(shù),見圖4。I/R組磷酸化MYPT1水平是正常組的5.7倍(P<0.01),說明RHO激酶在心肌細(xì)胞缺血再灌注后有明顯的激活。用F1、F2、F3組法舒地爾干預(yù)后,磷酸化MYPT1水平較I/R組分別降低24.6%、40.1%、60.1%,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05).提示心肌細(xì)胞I/R后有Rho激酶激活

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