【摘要】：泰素是廣泛應(yīng)用于臨床的一類抗腫瘤化療藥物,主要適用于卵巢癌,乳腺癌,非小細(xì)胞肺癌等腫瘤的治療。泰素作為一種抗微管藥物,主要通過促進(jìn)微管蛋白聚合,抑制解聚,保持微管蛋白穩(wěn)定,抑制細(xì)胞有絲分裂,從而達(dá)到抑制腫瘤增殖的目的。近些年來科學(xué)家們偶然發(fā)現(xiàn),盡管泰素和LPS(脂多糖)的分子構(gòu)象差異較大,但是泰素卻可以模擬LPS與TLR4 (Toll like receptor 4)結(jié)合并活化其下游信號分子,促進(jìn)一系列炎性因子的釋放,泰素的這種作用先后于巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞等多種表達(dá)TLR4的固有免疫細(xì)胞中得以證實。隨著對固有免疫分子TLR家族(TLRs)研究的深入,人們發(fā)現(xiàn)大部分TLRs(如：TLR2、4、6、7、8、9等)在適應(yīng)性免疫細(xì)胞也有表達(dá),其中包括CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)、CD4+T和CD8+T細(xì)胞等,并且其配體也可以激活相應(yīng)的TLRs分子,引起細(xì)胞活化等一系列的級聯(lián)反應(yīng)。 我們實驗室前期工作也發(fā)現(xiàn)TLRs在調(diào)節(jié)性T細(xì)胞上表達(dá),并且發(fā)現(xiàn)泰素可以下調(diào)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的數(shù)量,同時結(jié)合文獻(xiàn),啟發(fā)我們提出這樣一個假設(shè)：泰素是否可以通過直接作用于調(diào)節(jié)性T細(xì)胞或效應(yīng)性T細(xì)胞(Teff)表面的TLR4,來調(diào)節(jié)化療過程中機(jī)體的適應(yīng)性免疫應(yīng)答,從而為尋找化療后進(jìn)行免疫治療的有利時機(jī)提供新的方向。 因此,我們首先在體外檢測了Treg和Teff表面的TLR4表達(dá)情況,以及泰素對Treg和Teff的作用,進(jìn)一步應(yīng)用TLR4突變小鼠(C3H/HeJ mice)和TLR4的RNA干擾技術(shù)驗證泰素對這兩種細(xì)胞亞群的影響是否是通過TLR4的途徑,結(jié)果發(fā)現(xiàn)泰素對其作用與TLR4關(guān)系不大；然而,我們在后續(xù)的實驗中發(fā)現(xiàn)Bcl-2是泰素作用于淋巴細(xì)胞的靶點,并進(jìn)一步探討了Bcl-2分子在泰素對Treg和Teff影響中的作用,嘗試尋找化療藥物泰素對適應(yīng)性免疫應(yīng)答作用的新機(jī)制,為其臨床應(yīng)用提供相應(yīng)的理論依據(jù)。 第一部分泰素對Treg和Teff細(xì)胞的不同作用 化療藥物泰素是臨床腫瘤治療的常見藥物,然而其毒副作用之一,就是在殺傷腫瘤的同時往往使淋巴細(xì)胞減少。因此為了探討化療藥物泰素對機(jī)體免疫系統(tǒng)的影響,我們用3LL腫瘤細(xì)胞株(小鼠非小細(xì)胞肺癌來源)建立了C57BL/6小鼠荷瘤模型,并以10mg/kg泰素腹腔注射進(jìn)行治療。第四天,處死小鼠并檢測其脾臟淋巴細(xì)胞格局,我們發(fā)現(xiàn)CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞亞群,即Treg細(xì)胞亞群比例明顯減少。體外分離出T細(xì)胞經(jīng)CD3/28 mAb刺激48小時后,使用不同劑量泰素處理24小時,結(jié)果顯示Foxp3+細(xì)胞亞群也顯著減少。這些現(xiàn)象說明化療藥物泰素可以減少Treg細(xì)胞亞群的比例。 其后,我們體外分離出Treg和Teff,分別用泰素處理,發(fā)現(xiàn)相同劑量泰素處理后的Treg細(xì)胞活力明顯下降,而Teff變化不大。同時我們進(jìn)一步檢測了這兩群細(xì)胞的細(xì)胞因子分泌功能,發(fā)現(xiàn)Treg的抑制性細(xì)胞因子分泌明顯下降而Teff的分泌情況無變化；除此之外我們還檢測了泰素處理后Treg的標(biāo)志性分子Foxp3表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)其熒光強(qiáng)度也明顯減弱。相同的實驗同時也在未荷瘤的正常小鼠上進(jìn)行,并且結(jié)果相似。以上實驗結(jié)果表明,泰素可以選擇性的作用于Treg而對Teff的影響不大,這有可能成為化療后的生物治療新途徑。 第二部分泰素對Treg和Teff不同作用的機(jī)制研究 通過第一部分實驗,我們觀察到Treg和Teff胞對泰素的不同反應(yīng),于是我們開始探討其不同反應(yīng)可能的機(jī)制。最近幾年來人們發(fā)現(xiàn)在適應(yīng)性免疫細(xì)胞如Teff,Treg上都有固有免疫分子TLRs的表達(dá),包括TLR4；而且泰素可以模擬TLR4配體LPS的作用,活化TLR4信號。因此我們推測：既然Treg和Teff兩群T細(xì)胞都有TLR4的表達(dá),那他們的表達(dá)情況是否相同,泰素是否可以通過TLR4的途徑影響其功能,這種影響是否與我們的實驗現(xiàn)象相一致。 于是我們通過MACS細(xì)胞分選得到Treg和Teff,觀察其TLR4表達(dá)情況,無論是來源于3LL荷瘤C57BL/6小鼠還是正常C57BL/6小鼠,Treg細(xì)胞TLR4的熒光強(qiáng)度表達(dá)都比Teff強(qiáng),這與文獻(xiàn)報道相符。提示這兩群細(xì)胞TLR4表達(dá)的差異可能是造成其對泰素的不同反應(yīng)的原因。我們再次從3LL荷瘤C57BL/6小鼠和正常C57BL/6小鼠中分選Treg和Teff細(xì)胞,體外培養(yǎng)48小時后,加入泰素刺激,分別在12小時和24小時收集細(xì)胞,利用RT-PCR和流式細(xì)胞術(shù)檢測TLR4在這兩群細(xì)胞的表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn)無論是在12小時還是24小時,在RNA和蛋白水平都未檢測到TLR4在這兩群細(xì)胞的明顯變化。通過以上實驗我們并未發(fā)現(xiàn)TLR4被激活,因此我們又使用了C3H/HeJ小鼠(C3H/HeJ小鼠的TLR4基因位點突變,LPS刺激其不會引起TLR4信號的傳導(dǎo)以及炎性細(xì)胞因子的分泌)末進(jìn)一步驗證以上實驗結(jié)果。我們采用腹腔注射泰素10mg/kg,對照組腹腔注射PBS,4天后處死小鼠,取其脾臟并檢測其CD4+CD25+Foxp3+細(xì)胞比例,結(jié)果發(fā)現(xiàn)無論是C57BL/6小鼠還是C3H/HeJ小鼠,與對照組相比,其Treg比例都有明顯下降,但二種系小鼠實驗組之間無統(tǒng)計學(xué)差異；體外細(xì)胞因子分泌和細(xì)胞活力檢測均得到相似結(jié)果,即泰素對C57BL/6和C3H/HeJ小鼠的作用相同。除此之外,我們還利用PEI試劑體內(nèi)轉(zhuǎn)染的方法,對C57BL/6小鼠腹腔注射si-RNA-TLR4質(zhì)粒來沉默小鼠TLR4的表達(dá),然后注射10 mg/kg泰素,4天后觀察小鼠體內(nèi)Treg的變化,結(jié)果仍然與C57BL/6小鼠、C3H/HeJ小鼠相似,其Treg比例明顯下降。因此,該部分結(jié)果顯示泰素對Treg和Teff細(xì)胞的不同作用并不是由于其TLR4表達(dá)的不同所引起,可能存在其它機(jī)制。為了進(jìn)一步尋找泰素對Treg和Teff不同作用的機(jī)制,我們首先利用MACS分選出Treg和Teff細(xì)胞,CD3/CD28活化48小時,之后加入泰素處理24小時,AnnexinⅤ/PI試劑盒檢測細(xì)胞凋亡,結(jié)果顯示Treg細(xì)胞凋亡較Teff明顯。該結(jié)果同時在DAPI染色試驗中得到驗證,Treg細(xì)胞核形態(tài)發(fā)生明顯的凋亡改變。這提示泰素對Treg和Teff作用不同的機(jī)制可能是由于兩種細(xì)胞對凋亡刺激敏感性的差異所引起。 泰素殺傷腫瘤的作用主要是抑制微管解聚,終止腫瘤細(xì)胞有絲分裂,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,因此我們需要驗證泰素誘導(dǎo)Treg凋亡是否是通過對微管的作用所介導(dǎo)。因此,我們將MACS分選出的Treg和Teff細(xì)胞,經(jīng)CD3/CD28活化48小時,然后泰素作用24小時,將兩群細(xì)胞按照實驗組、對照組分別制成細(xì)胞涂片并固定,然后進(jìn)行免疫熒光染色,用FITC-anti-a-tubulin標(biāo)記微管蛋白,用DAPI標(biāo)記細(xì)胞核,然后用熒光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞微管變化,結(jié)果顯示泰素處理前后其微管未發(fā)生顯著性變化,說明本研究所用劑量的泰素對Treg細(xì)胞的凋亡作用主要不是通過抑制微管的解聚,終止細(xì)胞有絲分裂所致。 由于泰素可與抗凋亡家族的主要分子Bcl-2的特異性位點結(jié)合,調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的凋亡,因此我們推測泰素是否可以通過作用于Treg上的Bcl-2分子來調(diào)控其凋亡。用Western Blot對Bcl-2進(jìn)行檢測,發(fā)現(xiàn)泰素作用24和48小時,均可以顯著下調(diào)Treg的Bcl-2表達(dá),而對Teff細(xì)胞沒有影響。同時,我們檢測了Bcl-2家族的另一個促凋亡分子Bax,觀察其是否參與了這一過程,結(jié)果表明泰素作用后Treg細(xì)胞Bax的表達(dá)上調(diào)而Teff細(xì)胞變化不明顯。該家族的另外一個抗凋亡分子Bcl-xl經(jīng)檢測在這兩群細(xì)胞中都沒有明顯改變。 為了進(jìn)一步驗證Bcl-2參與了泰素選擇性誘導(dǎo)Treg細(xì)胞凋亡的作用,我們應(yīng)用了Bcl-2抑制劑(ABT 737),阻斷抗凋亡分子Bcl-2的通路,來證明該機(jī)制的正確性。實驗結(jié)果顯示,在加入阻斷劑后,與對照組相比,泰素喪失了其選擇性誘導(dǎo)Treg細(xì)胞凋亡的作用,而對Treg和Teff細(xì)胞的無影響。因此,通過這一部分的實驗我們證明了泰素對Treg和Teff細(xì)胞的不同作用是通過Bcl-2的通路,一定劑量的泰素可以下調(diào)Bcl-2的表達(dá),從而使其凋亡增加；而對Teff Bcl-2表達(dá)無影響。 綜上所述,本研究闡明了化療藥物泰素在一定劑量下可以選擇性作用于Treg細(xì)胞使其凋亡,而對Teff細(xì)胞沒有作用,這種現(xiàn)象并不是通過TLR4途徑或干擾其微管蛋白,而是由于泰素可以下調(diào)Treg細(xì)胞抗凋亡分子Bcl-2,同時上調(diào)Bax蛋白的表達(dá),而對Teff細(xì)胞無影響。
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2.泰素對Trcg和Teff細(xì)胞活力的影響為了進(jìn)一步研究泰素對Treg和Teff細(xì)胞的影響，我們用磁珠分選的方法分離3LL荷瘤小鼠脾臟的Treg和Teff細(xì)胞，純度達(dá)93%以上，如圖1.2(A)。Treg和Teff細(xì)胞用 CD3/28mAb刺激48小時，然后分別與0.1抖M、l抖M泰素共培養(yǎng)24h，收集細(xì)胞，苔盼藍(lán)計數(shù)細(xì)胞活力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)泰素處理后的Treg細(xì)胞活力明顯降低，而Teff細(xì)胞活力無明顯變化(P<0.05)(圖1.2)。我們在正常小鼠的實驗中得到同樣結(jié)果(圖1.2)Treg :::::::， ，，云 云一一::介介，，一崖‘”‘一腫幾 叮---93.86叨，亡叼OO...CC盯匕口01洲C二1洲乃的邪。

本文編號：2558607