【摘要】：泰素是廣泛應用于臨床的一類抗腫瘤化療藥物,主要適用于卵巢癌,乳腺癌,非小細胞肺癌等腫瘤的治療。泰素作為一種抗微管藥物,主要通過促進微管蛋白聚合,抑制解聚,保持微管蛋白穩(wěn)定,抑制細胞有絲分裂,從而達到抑制腫瘤增殖的目的。近些年來科學家們偶然發(fā)現(xiàn),盡管泰素和LPS(脂多糖)的分子構(gòu)象差異較大,但是泰素卻可以模擬LPS與TLR4 (Toll like receptor 4)結(jié)合并活化其下游信號分子,促進一系列炎性因子的釋放,泰素的這種作用先后于巨噬細胞、單核細胞等多種表達TLR4的固有免疫細胞中得以證實。隨著對固有免疫分子TLR家族(TLRs)研究的深入,人們發(fā)現(xiàn)大部分TLRs(如：TLR2、4、6、7、8、9等)在適應性免疫細胞也有表達,其中包括CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細胞(Treg)、CD4+T和CD8+T細胞等,并且其配體也可以激活相應的TLRs分子,引起細胞活化等一系列的級聯(lián)反應。 我們實驗室前期工作也發(fā)現(xiàn)TLRs在調(diào)節(jié)性T細胞上表達,并且發(fā)現(xiàn)泰素可以下調(diào)調(diào)節(jié)性T細胞的數(shù)量,同時結(jié)合文獻,啟發(fā)我們提出這樣一個假設：泰素是否可以通過直接作用于調(diào)節(jié)性T細胞或效應性T細胞(Teff)表面的TLR4,來調(diào)節(jié)化療過程中機體的適應性免疫應答,從而為尋找化療后進行免疫治療的有利時機提供新的方向。 因此,我們首先在體外檢測了Treg和Teff表面的TLR4表達情況,以及泰素對Treg和Teff的作用,進一步應用TLR4突變小鼠(C3H/HeJ mice)和TLR4的RNA干擾技術(shù)驗證泰素對這兩種細胞亞群的影響是否是通過TLR4的途徑,結(jié)果發(fā)現(xiàn)泰素對其作用與TLR4關(guān)系不大；然而,我們在后續(xù)的實驗中發(fā)現(xiàn)Bcl-2是泰素作用于淋巴細胞的靶點,并進一步探討了Bcl-2分子在泰素對Treg和Teff影響中的作用,嘗試尋找化療藥物泰素對適應性免疫應答作用的新機制,為其臨床應用提供相應的理論依據(jù)。 第一部分泰素對Treg和Teff細胞的不同作用 化療藥物泰素是臨床腫瘤治療的常見藥物,然而其毒副作用之一,就是在殺傷腫瘤的同時往往使淋巴細胞減少。因此為了探討化療藥物泰素對機體免疫系統(tǒng)的影響,我們用3LL腫瘤細胞株(小鼠非小細胞肺癌來源)建立了C57BL/6小鼠荷瘤模型,并以10mg/kg泰素腹腔注射進行治療。第四天,處死小鼠并檢測其脾臟淋巴細胞格局,我們發(fā)現(xiàn)CD4+CD25+Foxp3+T細胞亞群,即Treg細胞亞群比例明顯減少。體外分離出T細胞經(jīng)CD3/28 mAb刺激48小時后,使用不同劑量泰素處理24小時,結(jié)果顯示Foxp3+細胞亞群也顯著減少。這些現(xiàn)象說明化療藥物泰素可以減少Treg細胞亞群的比例。 其后,我們體外分離出Treg和Teff,分別用泰素處理,發(fā)現(xiàn)相同劑量泰素處理后的Treg細胞活力明顯下降,而Teff變化不大。同時我們進一步檢測了這兩群細胞的細胞因子分泌功能,發(fā)現(xiàn)Treg的抑制性細胞因子分泌明顯下降而Teff的分泌情況無變化；除此之外我們還檢測了泰素處理后Treg的標志性分子Foxp3表達情況,發(fā)現(xiàn)其熒光強度也明顯減弱。相同的實驗同時也在未荷瘤的正常小鼠上進行,并且結(jié)果相似。以上實驗結(jié)果表明,泰素可以選擇性的作用于Treg而對Teff的影響不大,這有可能成為化療后的生物治療新途徑。 第二部分泰素對Treg和Teff不同作用的機制研究 通過第一部分實驗,我們觀察到Treg和Teff胞對泰素的不同反應,于是我們開始探討其不同反應可能的機制。最近幾年來人們發(fā)現(xiàn)在適應性免疫細胞如Teff,Treg上都有固有免疫分子TLRs的表達,包括TLR4；而且泰素可以模擬TLR4配體LPS的作用,活化TLR4信號。因此我們推測：既然Treg和Teff兩群T細胞都有TLR4的表達,那他們的表達情況是否相同,泰素是否可以通過TLR4的途徑影響其功能,這種影響是否與我們的實驗現(xiàn)象相一致。 于是我們通過MACS細胞分選得到Treg和Teff,觀察其TLR4表達情況,無論是來源于3LL荷瘤C57BL/6小鼠還是正常C57BL/6小鼠,Treg細胞TLR4的熒光強度表達都比Teff強,這與文獻報道相符。提示這兩群細胞TLR4表達的差異可能是造成其對泰素的不同反應的原因。我們再次從3LL荷瘤C57BL/6小鼠和正常C57BL/6小鼠中分選Treg和Teff細胞,體外培養(yǎng)48小時后,加入泰素刺激,分別在12小時和24小時收集細胞,利用RT-PCR和流式細胞術(shù)檢測TLR4在這兩群細胞的表達,結(jié)果發(fā)現(xiàn)無論是在12小時還是24小時,在RNA和蛋白水平都未檢測到TLR4在這兩群細胞的明顯變化。通過以上實驗我們并未發(fā)現(xiàn)TLR4被激活,因此我們又使用了C3H/HeJ小鼠(C3H/HeJ小鼠的TLR4基因位點突變,LPS刺激其不會引起TLR4信號的傳導以及炎性細胞因子的分泌)末進一步驗證以上實驗結(jié)果。我們采用腹腔注射泰素10mg/kg,對照組腹腔注射PBS,4天后處死小鼠,取其脾臟并檢測其CD4+CD25+Foxp3+細胞比例,結(jié)果發(fā)現(xiàn)無論是C57BL/6小鼠還是C3H/HeJ小鼠,與對照組相比,其Treg比例都有明顯下降,但二種系小鼠實驗組之間無統(tǒng)計學差異；體外細胞因子分泌和細胞活力檢測均得到相似結(jié)果,即泰素對C57BL/6和C3H/HeJ小鼠的作用相同。除此之外,我們還利用PEI試劑體內(nèi)轉(zhuǎn)染的方法,對C57BL/6小鼠腹腔注射si-RNA-TLR4質(zhì)粒來沉默小鼠TLR4的表達,然后注射10 mg/kg泰素,4天后觀察小鼠體內(nèi)Treg的變化,結(jié)果仍然與C57BL/6小鼠、C3H/HeJ小鼠相似,其Treg比例明顯下降。因此,該部分結(jié)果顯示泰素對Treg和Teff細胞的不同作用并不是由于其TLR4表達的不同所引起,可能存在其它機制。為了進一步尋找泰素對Treg和Teff不同作用的機制,我們首先利用MACS分選出Treg和Teff細胞,CD3/CD28活化48小時,之后加入泰素處理24小時,AnnexinⅤ/PI試劑盒檢測細胞凋亡,結(jié)果顯示Treg細胞凋亡較Teff明顯。該結(jié)果同時在DAPI染色試驗中得到驗證,Treg細胞核形態(tài)發(fā)生明顯的凋亡改變。這提示泰素對Treg和Teff作用不同的機制可能是由于兩種細胞對凋亡刺激敏感性的差異所引起。 泰素殺傷腫瘤的作用主要是抑制微管解聚,終止腫瘤細胞有絲分裂,誘導細胞凋亡,因此我們需要驗證泰素誘導Treg凋亡是否是通過對微管的作用所介導。因此,我們將MACS分選出的Treg和Teff細胞,經(jīng)CD3/CD28活化48小時,然后泰素作用24小時,將兩群細胞按照實驗組、對照組分別制成細胞涂片并固定,然后進行免疫熒光染色,用FITC-anti-a-tubulin標記微管蛋白,用DAPI標記細胞核,然后用熒光共聚焦顯微鏡觀察細胞微管變化,結(jié)果顯示泰素處理前后其微管未發(fā)生顯著性變化,說明本研究所用劑量的泰素對Treg細胞的凋亡作用主要不是通過抑制微管的解聚,終止細胞有絲分裂所致。 由于泰素可與抗凋亡家族的主要分子Bcl-2的特異性位點結(jié)合,調(diào)節(jié)腫瘤細胞的凋亡,因此我們推測泰素是否可以通過作用于Treg上的Bcl-2分子來調(diào)控其凋亡。用Western Blot對Bcl-2進行檢測,發(fā)現(xiàn)泰素作用24和48小時,均可以顯著下調(diào)Treg的Bcl-2表達,而對Teff細胞沒有影響。同時,我們檢測了Bcl-2家族的另一個促凋亡分子Bax,觀察其是否參與了這一過程,結(jié)果表明泰素作用后Treg細胞Bax的表達上調(diào)而Teff細胞變化不明顯。該家族的另外一個抗凋亡分子Bcl-xl經(jīng)檢測在這兩群細胞中都沒有明顯改變。 為了進一步驗證Bcl-2參與了泰素選擇性誘導Treg細胞凋亡的作用,我們應用了Bcl-2抑制劑(ABT 737),阻斷抗凋亡分子Bcl-2的通路,來證明該機制的正確性。實驗結(jié)果顯示,在加入阻斷劑后,與對照組相比,泰素喪失了其選擇性誘導Treg細胞凋亡的作用,而對Treg和Teff細胞的無影響。因此,通過這一部分的實驗我們證明了泰素對Treg和Teff細胞的不同作用是通過Bcl-2的通路,一定劑量的泰素可以下調(diào)Bcl-2的表達,從而使其凋亡增加；而對Teff Bcl-2表達無影響。 綜上所述,本研究闡明了化療藥物泰素在一定劑量下可以選擇性作用于Treg細胞使其凋亡,而對Teff細胞沒有作用,這種現(xiàn)象并不是通過TLR4途徑或干擾其微管蛋白,而是由于泰素可以下調(diào)Treg細胞抗凋亡分子Bcl-2,同時上調(diào)Bax蛋白的表達,而對Teff細胞無影響。
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2.泰素對Trcg和Teff細胞活力的影響為了進一步研究泰素對Treg和Teff細胞的影響，我們用磁珠分選的方法分離3LL荷瘤小鼠脾臟的Treg和Teff細胞，純度達93%以上，如圖1.2(A)。Treg和Teff細胞用 CD3/28mAb刺激48小時，然后分別與0.1抖M、l抖M泰素共培養(yǎng)24h，收集細胞，苔盼藍計數(shù)細胞活力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)泰素處理后的Treg細胞活力明顯降低，而Teff細胞活力無明顯變化(P<0.05)(圖1.2)。我們在正常小鼠的實驗中得到同樣結(jié)果(圖1.2)Treg :::::::， ，，云 云一一::介介，，一崖‘”‘一腫幾 叮---93.86叨，亡叼OO...CC盯匕口01洲C二1洲乃的邪。

本文編號：2558607