【摘要】： 前言 G蛋白偶聯(lián)受體(G protein coupled receptor,GPCR)自然界中最大的蛋白質(zhì)家族成員之一,存在于從低等動(dòng)物酵母至人類(lèi)器官,據(jù)統(tǒng)計(jì)大約1%的人類(lèi)基因組編碼GPCRs而30%的藥物是以GPCRs為靶點(diǎn)設(shè)計(jì)的。GPCR由一條400~600個(gè)氨基酸組成的多肽鏈構(gòu)成,這條多肽鏈有7個(gè)分肽段穿越細(xì)胞膜形成7個(gè)跨膜區(qū)(transmembrane domain,TMD)。補(bǔ)體裂解片段C5a受體(The complement C5 anaphylatoxin receptor , C5aR;CD88) GPCR家族成員之一,是7次跨膜α螺旋受體,其N(xiāo)端在細(xì)胞外側(cè),含有N-糖基化位點(diǎn); C端在細(xì)胞內(nèi),其上有磷酸化位點(diǎn)。中段七個(gè)分肽段穿越細(xì)胞膜形成7個(gè)跨膜區(qū),它們藉6個(gè)細(xì)胞外與細(xì)胞內(nèi)由親水性氨基酸構(gòu)成的突環(huán)連接起來(lái)。細(xì)胞外3個(gè)分別稱(chēng)為e1、e2及e3;細(xì)胞內(nèi)3個(gè)分別稱(chēng)為i1、i2及i3。e1和e2之間由兩個(gè)保守的Cys形成一個(gè)二硫鍵。不同GPCR的TMD為分子的保守區(qū),具有極大的相似性,而兩端區(qū)域及突環(huán)的氨基酸則變異程度較大。 C5aR主要表達(dá)于中性粒細(xì)胞,嗜堿性粒細(xì)胞及單核細(xì)胞上。野生型的C5aR的表達(dá)細(xì)胞分離困難,對(duì)C5aR的功能及信號(hào)事件的研究較難進(jìn)行。體外建立一個(gè)有生物學(xué)活性,穩(wěn)定表達(dá)C5aR的細(xì)胞株對(duì)我們進(jìn)一步研究C5aR的生物學(xué)功能有很大的意義。 目的 構(gòu)建重組人C5aR的真核表達(dá)載體并將其轉(zhuǎn)染入含有Gα16基因的Molt-4細(xì)胞中,獲得一株穩(wěn)定表達(dá)C5aR的細(xì)胞株。為以后繼續(xù)探討C5aR的生物學(xué)功能以及C5aR單克隆抗體的制備奠定基礎(chǔ)。 方法 通過(guò)RT-PCR從人中性粒細(xì)胞中釣取C5aR全長(zhǎng)基因,重組到pGEM-T Easy vector中進(jìn)行基因克隆,經(jīng)核酸序列測(cè)定正確后,將其克隆入真核表達(dá)載體pcDNA4.0中,轉(zhuǎn)染至Molt-4細(xì)胞系并對(duì)其進(jìn)行穩(wěn)定篩選。通過(guò)Zeocin加壓及亞克隆篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)C5aR的細(xì)胞株。Westen blot檢測(cè)了人標(biāo)準(zhǔn)C5a對(duì)Molt-4/C5aR細(xì)胞的激活作用,細(xì)胞內(nèi)鈣離子流動(dòng)檢測(cè)了Molt-4/C5aR細(xì)胞經(jīng)C5a刺激后第二信使鈣離子的調(diào)動(dòng)情況,小鼠肺灌洗實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Molt-4/C5aR細(xì)胞的趨化情況。 結(jié)果 構(gòu)建了真核表達(dá)載體pcDNA4.0/ C5aR的構(gòu)建并將其轉(zhuǎn)染至Molt-4細(xì)胞。利用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)C5aR的表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè),正常人新鮮血液中中性粒細(xì)胞上的C5aR表達(dá)率為98.25%,而此穩(wěn)定株C5aR的表達(dá)率為97.35%,幾乎等同與正常人新鮮血液中中性粒細(xì)胞上C5aR的表達(dá)量。PCR技術(shù)及Westen blot鑒定了轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞株中仍有Gα16的存在。Westen blot顯示了人標(biāo)準(zhǔn)C5a對(duì)Molt-4/C5aR細(xì)胞的激活作用,引起ERK1/2及PKB/AKT的磷酸化。細(xì)胞內(nèi)鈣離子流動(dòng)結(jié)果顯示了Molt-4/C5aR細(xì)胞經(jīng)C5a刺激后第二信使鈣離子的調(diào)動(dòng),小鼠肺灌洗實(shí)驗(yàn)說(shuō)明Molt-4/C5aR細(xì)胞對(duì)C5a很好的趨化情況。 結(jié)論 構(gòu)建了重組形式的C5aR真核表達(dá)載體pcDNA4.0/C5aR,并成功轉(zhuǎn)染至Molt-4細(xì)胞中。通過(guò)RT-PCR發(fā)現(xiàn)MOLT-4/C5aR細(xì)胞株中Gα16沒(méi)有丟失并能夠正常表達(dá)Gα16蛋白,可以進(jìn)行細(xì)胞的信號(hào)及功能研究。Westenblot試驗(yàn)結(jié)果顯示MOLT-4/C5aR細(xì)胞株經(jīng)C5a刺激后能夠引起ERK1/2及PKB/AKT的磷酸化,這更有利于我們對(duì)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路進(jìn)行更進(jìn)一步的研究并探索新的未知因子。C5a刺激MOLT-4/C5aR細(xì)胞株后可以引起鈣離子的顯著變化,并且有一定的時(shí)間和劑量依賴(lài)性。小鼠肺灌洗實(shí)驗(yàn)說(shuō)明Molt-4/C5aR細(xì)胞對(duì)C5a很好的趨化情況。
【圖文】：

16圖1.2真核表達(dá)載體酶切鑒定Fig1.2: Identification of pcDNA4.0/ C5aRM:DL2000 Marker 1-5: pcDNA4.0/ C5aR4.3 真核表達(dá)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的 Molt-4 細(xì)胞，計(jì)數(shù)細(xì)胞，并調(diào)整濃度為 1×107 個(gè)/ml。實(shí)驗(yàn)中首先穩(wěn)定電壓為 280V，調(diào)整電擊時(shí)間為 10ms、20ms、30ms、40ms；然后，固定電擊時(shí)間為 40 ms，調(diào)整電壓為 220V、240V、260V、280V。電擊后分別培養(yǎng) 1h 及 48h 后計(jì)數(shù)細(xì)胞的存活率。根據(jù)電擊后細(xì)胞活率為 50％左右時(shí)可以達(dá)到最佳的電轉(zhuǎn)效果，，選擇合適的 260V 電壓及 20ms 電擊時(shí)間。同時(shí)試驗(yàn)中選擇了每次 5μg 、10μg、15μg、20μg、25μg、30μg、35μg 或 40μg 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，觀察轉(zhuǎn)染的陽(yáng)性率以及細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度。確定了轉(zhuǎn)染及表達(dá)陽(yáng)性率較高的合適質(zhì)粒量 30μg。M 1 2 3 4 5bp20001000750500250100不同電壓電擊40ms?

(a) (b)圖1.6 C5aR的表達(dá)情況Fig1.6 The expression of C5aR proteinFig1.6 (a) Negative control(Molt-4/ pcDNA4.0).(b) The expression of C5aR protein in Molt-4/C5aR cell5 討論補(bǔ)體激活產(chǎn)物C5a是一種重要的前炎癥介質(zhì)，發(fā)生嚴(yán)重感染時(shí)過(guò)度產(chǎn)生5a血漿中可以達(dá)到10-100nM水平，此時(shí)可觸發(fā)細(xì)胞因子/趨化因子瀑布反應(yīng)致全身炎癥反應(yīng)綜合癥(SIRS)，這與器官潛在的損傷和多器官功能不全綜合MODS)相關(guān)[13]。本研究就是通過(guò)分離正常人的外周血中性粒細(xì)胞，TRAIZOL法提取總R
【學(xué)位授予單位】：河南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類(lèi)號(hào)】：R346

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4 趙

本文編號(hào)：2557899