【摘要】： 乙型腦炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)屬于黃病毒科黃病毒屬,主要在亞洲流行,可引起嚴(yán)重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)傳染病,感染后致死率高達30%左右,并有50%的存活者會留下永久性的神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥。目前國際通用的滅活疫苗存在著副作用較大且費用較高的問題,而我國應(yīng)用的減毒活疫苗未通過國際認(rèn)證且存在著一定的回復(fù)風(fēng)險,因此對于乙型腦炎疫苗的研究工作依然十分重要。 復(fù)制子表達系統(tǒng)是在RNA病毒感染性克隆的基礎(chǔ)上刪除病毒的結(jié)構(gòu)基因,亞克隆其它外源基因,利用(+)RNA病毒的自主復(fù)制特性,轉(zhuǎn)染細(xì)胞后表達自身非結(jié)構(gòu)蛋白以及外源蛋白。如果輔以表達病毒結(jié)構(gòu)蛋白的輔助載體共轉(zhuǎn)染細(xì)胞,可以重新包裝成新的假病毒顆粒。理論上講,復(fù)制子RNA在細(xì)胞胞漿內(nèi)大量擴增,使得外源基因也隨之高水平表達,是表達異源基因的良好載體。假病毒顆粒只具有“一次感染能力”,因為其包裝的RNA是去除了結(jié)構(gòu)基因的復(fù)制子,感染細(xì)胞后由于缺乏病毒的結(jié)構(gòu)蛋白,不能夠重新包裝成為病毒顆粒,不會感染周圍細(xì)胞,作為疫苗是安全的。近年來,KUNV、TBEV和YFV復(fù)制子載體系統(tǒng)已經(jīng)被報道可以作為發(fā)展新型疫苗的潛在的有用的工具。我們希望構(gòu)建JEV復(fù)制子載體系統(tǒng),并將其開發(fā)成為疫苗研究的新平臺。 我們在JEV疫苗株SA14-14-2基礎(chǔ)上,經(jīng)過優(yōu)化構(gòu)建了一系列復(fù)制子載體。分別將綠色熒光蛋白(EGFP)和LacZ報告基因插入復(fù)制子載體pCMW-2M、pCMW-G2R中。pCMW-2MEG轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞,24小時后可以觀察到EGFP的表達,在轉(zhuǎn)染72小時后更為明顯,在轉(zhuǎn)染7天后也能觀察到。流式細(xì)胞術(shù)定量檢測EGFP復(fù)制子轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞后有10%左右的陽性率。同樣,含Lac Z的復(fù)制子轉(zhuǎn)染細(xì)胞后也可獲得報告基因的表達。進一步為檢測復(fù)制子的體內(nèi)功能活性,我們將含Lac Z報告基因的復(fù)制子載體直接進行乳鼠腦內(nèi)注射,結(jié)果顯示在小鼠腦組織廣泛表達Lac Z,陽性信號強,覆蓋面積廣。這些結(jié)果表明了JEV復(fù)制子pCMW-2M能夠有效地復(fù)制并高效表達外源蛋白,為建立JEV復(fù)制子載體系統(tǒng)打下良好基礎(chǔ)。 建立穩(wěn)定表達結(jié)構(gòu)蛋白的細(xì)胞系是復(fù)制子系統(tǒng)用于獲得假病毒顆粒的重要環(huán)節(jié),細(xì)胞系的成功建立能夠使收獲假病毒顆粒的實驗步驟簡化,并且獲得的病毒量較多,進一步放大培養(yǎng)也成為現(xiàn)實。我們通過實驗克服了E蛋白對宿主細(xì)胞的毒性,建立了穩(wěn)定表達JEV結(jié)構(gòu)蛋白的細(xì)胞系,可包裝復(fù)制子產(chǎn)生假病毒顆粒,這是國內(nèi)外首次關(guān)于JEV包裝細(xì)胞系的報道。 在先期實驗中,我們嘗試構(gòu)建表達prM-E蛋白的細(xì)胞系,但是由于E蛋白對宿主細(xì)胞的毒性大,挑選不到有效表達prM-E蛋白的細(xì)胞克隆。為解決這一問題,我們先后進行了真核表達載體的改造、更換表達效率低的真核表達載體、構(gòu)建在表達基因前添加信號肽序列的載體、構(gòu)建了改變prM-E基因FURIN切割位點的真核表達載體等工作,但是都沒有取得滿意的效果。由于整體結(jié)構(gòu)蛋白的完整性對于結(jié)構(gòu)蛋白的翻譯后加工有促進作用,添加JEV C基因可能對結(jié)構(gòu)蛋白的表達起穩(wěn)定作用,并且能進一步促進病毒的包裝。因此我們構(gòu)建了含有完整JEV結(jié)構(gòu)基因的質(zhì)粒pcJECME,轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞后挑取細(xì)胞克隆,經(jīng)過ELISA、Westren Blot、IFA的鑒定,最終獲得了穩(wěn)定表達JEV結(jié)構(gòu)蛋白的細(xì)胞系,經(jīng)過100代次以上的培養(yǎng),仍有50%以上的細(xì)胞表達目的蛋白。用復(fù)制子載體pCMW-2MLac轉(zhuǎn)染該細(xì)胞克隆,Lac Z的表達能力有了明顯的提高。 利用復(fù)制子系統(tǒng)獲得假病毒顆粒的方式有兩種,一種是復(fù)制子載體和表達結(jié)構(gòu)蛋白的真核表達載體共轉(zhuǎn)染敏感細(xì)胞;另一種是復(fù)制子載體轉(zhuǎn)染穩(wěn)定表達結(jié)構(gòu)蛋白的細(xì)胞系。由于前者操作較為復(fù)雜且獲得的假病毒滴度較低,我們利用已經(jīng)構(gòu)建好的JEV結(jié)構(gòu)蛋白細(xì)胞系,包裝JEV復(fù)制子載體以獲得只具有一次感染能力的JEV假病毒顆粒。通過電鏡及RT-PCR的方法鑒定了復(fù)制子轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞系后可產(chǎn)生假病毒顆粒,滴度可達到1.6×105 U/ml。將其免疫小鼠后,血清特異性抗E蛋白抗體滴度可達到1:2560,中和抗體滴度可達1:128。可對73%的小鼠保護免受病毒攻擊。以上實驗結(jié)果均表明JEV假病毒顆粒具有良好的免疫原性。 由于假病毒顆粒疫苗具有很好的應(yīng)用前景,我們首次將JEV復(fù)制子載體系統(tǒng)用于炭疽疫苗的研究。炭疽桿菌(Bacillus anthracis)是一種能形成芽胞的革蘭氏陽性菌,由它感染引起的炭疽病是嚴(yán)重危害人類的一種致死性的重大傳染病,同時它又是一種潛在的生物戰(zhàn)劑,炭疽疫苗的研究對于生物反恐具有重要的意義。PA是炭疽毒素的三大組分之一,是引起機體免疫應(yīng)答的最有效的免疫原,單獨應(yīng)用沒有毒性,當(dāng)前應(yīng)用的疫苗主要成分是PA。將構(gòu)建好的含炭疽PA4基因的JEV復(fù)制子轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞系,經(jīng)過制備和純化可得到病毒滴度為5×105U/ml的假病毒顆粒,免疫小鼠后能產(chǎn)生特異性的抗體,在免疫二次后的抗體滴度為1:1280,進一步驗證了JEV復(fù)制子載體系統(tǒng)開發(fā)研究新型疫苗是可行的。 由于JEV E蛋白可誘導(dǎo)產(chǎn)生保護性中和抗體并對病毒毒力起重要作用,是重要的抗原成份。我們還表達純化了JEV E蛋白結(jié)構(gòu)域Ⅲ,研究其作為亞單位疫苗預(yù)防JEV感染的可能。高效可溶性表達了融合蛋白Trx-JEDⅢ,表達量約占菌體蛋白的75%。利用純化的JEDⅢ蛋白免疫新西蘭兔,獲得了高達1:4×105滴度的抗JEV抗體;免疫BALB/C鼠,獲得了1:8×104滴度的抗JEV抗體和1:2×103滴度的抗YFV抗體。免疫小鼠血清的中和抗體可達1:256。實驗表明JE DIII蛋白的抗原性及免疫原性較好,有開發(fā)研制成亞單位疫苗的潛能。 綜上所述,本研究建立了穩(wěn)定的JEV復(fù)制子載體系統(tǒng),可在體內(nèi)外高效表達EGFP、LacZ報告基因。構(gòu)建了高效穩(wěn)定表達結(jié)構(gòu)蛋白的細(xì)胞系,包裝復(fù)制子后可產(chǎn)生1.6×105 U/ml的假病毒顆粒,具有良好的免疫原性,并獲得了PA-JEV假病毒顆粒,免疫小鼠后可獲得特異性抗體。總的來說,我們首次建立了JEV復(fù)制子載體系統(tǒng)的技術(shù)平臺,為今后開發(fā)研究多種新型疫苗奠定了堅實的基礎(chǔ)。
【圖文】：

前 言1 日本腦炎病毒概況日本腦炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)屬于黃病毒科（Flaviridae）（flavivirus），與黃熱病毒、西尼羅病毒、圣路易斯病毒、默里谷病毒、昆津病一個血清型。可引起嚴(yán)重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)傳染病，主要在亞洲流行，感染后致%左右；并有50 %的存活者會留下永久性的神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥[1,2]。日本腦炎病毒為單股正鏈RNA病毒，基因組全長10976 bp，病毒基因組R個長的開放讀碼框架(ORF)[3]。5’端有I 型帽子結(jié)構(gòu)，3’端無多聚腺苷酸(pol病毒顆粒為球形，直徑約40nm，有包膜，呈20面體對稱結(jié)構(gòu)。病毒顆粒有3 種結(jié)M、C)和7種非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5)[4-6]，為包膜糖蛋白，C為核心蛋白，E蛋白可凝集紅細(xì)胞，，介導(dǎo)病毒與宿主細(xì)胞粘附NS3蛋白可引發(fā)中和抗體。

不能被包裝，故制備的假病毒顆粒感染細(xì)胞后，僅能進行一輪復(fù)制，而不能繁殖子代，見圖 2c。圖2 復(fù)制子載體及其三種遞送方式a 基于RNA的甲病毒復(fù)制子載體，b 基于DNA的甲病毒復(fù)制子載體，c 共轉(zhuǎn)染制備重組病毒顆粒（RVP）及其感染遞送復(fù)制子載體。acb
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號】：R392.1

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本文編號：2554422