【摘要】： 一氧化氮(nitric oxide,NO)是生物體內(nèi)重要的活性分子。NO參與了生物體內(nèi)細胞的分化和凋亡、血管松弛、神經(jīng)傳遞、免疫防御反應(yīng)以及種子萌發(fā)、下胚軸伸長、葉擴展、根生長等許多重要生理過程,被認為是多功能的第二信使。NO在動物體和高等植物中的研究早已受到廣泛的重視,但是NO在細菌中,尤其是在細菌形成的多細胞結(jié)構(gòu)—細菌生物膜(biofilm)中的作用卻極少有人研究。細菌生物膜是由細菌和其分泌的胞外基質(zhì)在物體表面形成的高度組織化的多細胞結(jié)構(gòu),是細菌產(chǎn)生抗生素耐藥和逃避機體免疫系統(tǒng)攻擊的主要原因。金黃色葡萄球菌(S. aureus)是院內(nèi)感染的重要病原體之一,其致病機理與其生物膜的生成密切相關(guān)。本論文旨在研究NO對金黃色葡萄球菌生物膜形成的影響,為進一步研究NO在生物膜中的作用和機制奠定了基礎(chǔ)。 首先,利用實時熒光定量PCR檢測了S. aureus生物膜和浮游細菌中一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)基因nos的mRNA表達水平,結(jié)果表明生物膜中nos的表達量明顯高于浮游菌,表明NO可能對生物膜的形成具有重要作用。為了檢測NO對生物膜的影響,通過外源加入NO供體SNP和NO清除劑PTIO觀察細菌生物膜的變化。結(jié)果表明SNP能夠明顯促進S. aureus生物膜的生長,而加入NO清除劑PTIO后能夠抑制SNP引起的生物膜的增加。 為了進一步研究NO對生物膜的影響,利用同源重組方法構(gòu)建了S. aureus nos基因缺失突變株。在突變株的構(gòu)建過程中,我們發(fā)現(xiàn)由于S. aureus細胞壁厚而致密而且穿梭重組質(zhì)粒較大,使用目前的常規(guī)轉(zhuǎn)化方法無法導(dǎo)入外源性DNA,限制了遺傳操作的進行。為了提高轉(zhuǎn)化效率,我們利用溶菌酶、溶葡萄球菌酶或Triton X-100在電擊轉(zhuǎn)化前對細菌進行預(yù)處理,使轉(zhuǎn)化效率顯著提高,最高達到1.7×10~3cfu/μg DNA,從而建立了一種簡便、高效的轉(zhuǎn)化方法。同源重組載體pMADΔnos的構(gòu)建是將PCR獲得的nos基因上下游同源序列和壯觀霉素抗性基因連入穿梭載體pMAD。pMADΔnos載體首先轉(zhuǎn)入S. aureus RN4220,經(jīng)修飾后轉(zhuǎn)入S. aureus RN6390,利用溫度敏感性和抗生素抗性篩選同源重組體,成功構(gòu)建了S. aureus RN6390 nos基因缺失突變株。生物膜形成實驗表明nos缺失突變株的生物膜形成能力明顯減弱,其生物膜的量比野生型減少了30%以上;最低生物膜消除濃度(MBEC)試驗表明突變株生物膜對抗生素的敏感性提高為野生型的兩倍。 綜上所述,本論文建立了一種簡便高效的S. aureus外源DNA轉(zhuǎn)化方法,并利用同源重組技術(shù)構(gòu)建了S. aureus的nos基因缺失突變株。研究結(jié)果證明,外源NO促進了S. aureus生物膜的生長,而nos基因的缺失可以抑制S. aureus生物膜的生長并增強生物膜對抗生素的敏感性。本論文揭示了NO對金黃色葡萄球菌生物膜的作用,為深入研究NO在細菌生物膜形成過程中的作用和機制提供了實驗基礎(chǔ)和理論依據(jù),同時,為細菌生物膜形成的調(diào)節(jié)機制和細菌生物膜相關(guān)感染的預(yù)防和治療提供了新的思路。
【圖文】：

圖 1 NO 的生物合成在 NO 的生物合成中，NOS 是主要的限速因子，根據(jù) NOS 基因序列和細胞同分為 3 型[7-9]:內(nèi)皮型 NOS(eNOS)為內(nèi)皮細胞所特有；神經(jīng)元(macNOS)主要存在于中樞神經(jīng)、外周神經(jīng)系統(tǒng)；誘導(dǎo)型 NOS(iNOS)主要存噬細胞中。根據(jù)NOS調(diào)節(jié)方式及特點主要分為2型，即組成型NOS(constituti，cNOS)和誘導(dǎo)型 NOS(inducible NOS，iNOS)，其中 eNOS 和 nNOS 合稱為 NOS(cNOS)，macNOS 為 iNOS。cNOS 需要依靠鈣離子或鈣調(diào)蛋白激活、NADPH 的參與才能將 L－精氨酸胍氨酸，釋放 NO。cNOS 的單體就具有生物活性，由于催化發(fā)應(yīng)迅速而短暫的 NO 少，人們認為它能參與傳遞介質(zhì)和調(diào)節(jié)介質(zhì)。iNOS 在內(nèi)毒素或某些細胞因子，如腫瘤壞死因子(TNF)、γ－干擾素(INF－激及四氫生物喋呤和 NADPH 作用下可被激活，該過程一般需要 4－6 小時性的單體 iNOS 分子量為 130KD，只有在形成分子量為 25OKD 的二聚體時

一氧化氮對金黃色葡萄球菌生物膜影響的研究cAMP 的含量[16-18]。作為一種新型的神經(jīng)遞質(zhì)，NO 與傳統(tǒng)神經(jīng)遞質(zhì)存在區(qū)別[19]:傳統(tǒng)神經(jīng)遞質(zhì)貯存在突觸小泡中以胞泌方式釋放，作用時間短暫快速而且作用于受體能引起離子通道的開放。NO 分子結(jié)構(gòu)簡單，而且有毒性；只在需要時才合成，不貯存在突觸小泡中，廣泛分布與胞漿內(nèi)；通過擴散進入鄰近神經(jīng)元，，作用于細胞內(nèi)可溶性鳥苷酸環(huán)化酶亞鐵原卟啉上的鐵離子，從而實現(xiàn)各種不同的生理功能。2.3 動物中 NO 的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)NO 是一種較小的生物活性分子，可自由穿過細胞膜作用于細胞內(nèi)的靶分子，并以相對特異方式控制多種細胞的功能，NO 的細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑研究首先而且主要是在動物中進行的，目前普遍認為，動物體內(nèi) NO 的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路分為環(huán)鳥苷酸(cGMP)依賴途徑和非 cGMP 依賴途徑兩種類型[20]，如圖 2 所示：
【學(xué)位授予單位】：中國海洋大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號】：R378

【引證文獻】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 李蕾;金黃色葡萄球菌isdA缺失株的構(gòu)建及其免疫活性的研究[D];吉林大學(xué);2012年

本文編號：2552400