【摘要】： 諸多研究結(jié)果表明:肝癌的發(fā)生和發(fā)展與線粒體有著密切的聯(lián)系,而黃曲霉毒素B1(AFB1)又是誘導(dǎo)肝癌發(fā)生的最主要外界因素之一。AFB1不僅能使小鼠逐漸消瘦,引發(fā)肝臟組織癌變,還能誘導(dǎo)或是抑制肝臟部分蛋白的表達(dá),idh3α蛋白是其差異蛋白之一。本研究制備的抗體可用于Western-blotting驗(yàn)證不同環(huán)境下哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)IDH的表達(dá)水平,并通過親和層析和免疫共沉淀等方法鑒定IDH的互作蛋白。 本研究首先將idh3α構(gòu)建到pET-32a上,并轉(zhuǎn)化到E.coli BL21(DE3)宿主菌中。通過IPTG誘導(dǎo)陽性菌,成功表達(dá)了IDH3α融合蛋白。并過Ni柱得到純化的蛋白,純化的蛋白用于免疫BALB/C實(shí)驗(yàn)小鼠,達(dá)到一定的效價(jià)后分別分離小鼠脾臟細(xì)胞制備單克隆抗體和提取脾臟RNA制備基因工程單鏈抗體。 將免疫后小鼠的脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞SP2/0融合,形成雜交瘤細(xì)胞,HAT培養(yǎng)液培養(yǎng)篩選,ELISA檢測(cè),陽性雜交瘤細(xì)胞克隆化3次,檢測(cè),篩選出一株能穩(wěn)定分泌高親和力、高特異性的單克隆抗體的細(xì)胞株,最后將抗體純化和性質(zhì)鑒定。 從免疫后小鼠的RNA中,反轉(zhuǎn)錄并擴(kuò)增單鏈抗體輕重連可變區(qū)基因片段,經(jīng)靈活短肽連接,組裝成單鏈抗體基因,再將此基因構(gòu)建到噬菌體載體上,建立噬菌體單鏈抗體庫,富集淘選,篩選出一株穩(wěn)定的高親和力、高特異性的重組子,然后進(jìn)行可溶性表達(dá),純化,鑒定,即可制備出單鏈抗體。
【圖文】：

101.2 黃曲霉毒素的化學(xué)結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)圖1-1所示的是幾種常見的黃曲霉毒素的化學(xué)結(jié)構(gòu)。黃曲霉毒素是結(jié)構(gòu)相似的一組化合物，均為二呋喃香豆素(difuranocoumarin)的衍生物。目前已經(jīng)分離鑒定的黃曲霉毒素有20余種，飼料中污染的黃曲霉毒素只有B1、 B2、 G1和G24種。AFB1和AFB2在紫外線照射下發(fā)藍(lán)色熒光，AFG1和AFG2在紫外線照射下發(fā)黃綠色熒光[1]；黃曲霉毒素耐熱，在一般的烹調(diào)加工溫度下很少被破壞，加熱到280℃才裂解破壞；黃曲霉毒素不溶于水，在酸性條件下也較穩(wěn)定，但在堿性條件下(pH>9)黃曲霉毒素的內(nèi)酯環(huán)形成香豆素鈉鹽，可迅速分解，此反應(yīng)可逆；黃曲霉毒素可溶解于油和一些有機(jī)溶劑中，如氯仿、甲醇等，但不溶于正己烷、石油醚和乙醚。1.3 黃曲霉毒素的毒理學(xué)AFB1本身并不是致癌物質(zhì)

術(shù)能構(gòu)建容量大、特異性強(qiáng)的完全人源性抗體，在 HIV 等病毒感染和腫瘤方面有獨(dú)特的優(yōu)越性和遠(yuǎn)大的應(yīng)用前景[38,39]。噬菌體抗體庫技術(shù)的原理簡(jiǎn)言之，就是用 PCR 技術(shù)從免疫細(xì)胞中擴(kuò)增體的重鏈可變區(qū)（VH）和輕鏈可變區(qū)（VL）基因，通過一段編碼連接肽基拼接后組裝成單鏈抗體基因（scFv），然后將其克隆到噬菌體載體上，使抗噬菌體的衣殼蛋白在噬菌體表面融合表達(dá)，然后利用抗原－抗體特異性結(jié)合出表達(dá)特異性抗體的噬菌體[40,41]，，并進(jìn)一步感染和擴(kuò)增。如果建庫過程中和 VL隨機(jī)組合，便可建成組合抗體文庫。構(gòu)建噬菌體抗體庫主要有以下幾個(gè)步驟：①抗原純化，免疫動(dòng)物；②提疫動(dòng)物脾細(xì)胞 RNA 并反轉(zhuǎn)錄為 cDNA；③擴(kuò)增 VH、VL，組裝 scFv；④噬表面抗體庫的構(gòu)建與淘選；⑤scFv 的可溶性表達(dá)與 ELISA 檢測(cè)。
【學(xué)位授予單位】：福建農(nóng)林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R392

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2551082