【摘要】： 嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合征(SARS)是一種以呼吸系統(tǒng)癥狀為主要表現(xiàn)的傳染性疾病,它的病原體為新型冠狀病毒(SARS-CoV)。由于其傳播速度快、致病性強(qiáng)、致死率高,已對全球造成巨大的危害。絕大多數(shù)傳染性疾病都屬于典型的多基因疾病,是致病微生物和宿主之間在長期的進(jìn)化過程中交互作用的結(jié)果。而宿主的遺傳因素在疾病的發(fā)生發(fā)展過程中起著非常重要的作用。SARS的臨床研究表明約有20%的病人發(fā)病兇險,而另外80%的病人病情平穩(wěn),可以痊愈,即不同個體間存在發(fā)病嚴(yán)重程度的差異;結(jié)合以往的數(shù)個關(guān)聯(lián)研究表明宿主的遺傳因素在SARS冠狀病毒致病過程中扮演了重要角色。本實(shí)驗(yàn)室在開展遺傳因素在重大傳染性疾病發(fā)生發(fā)展中的重要作用的研究中,探索了SARS-CoV的結(jié)構(gòu)及其與宿主的相互作用,發(fā)現(xiàn)與作為SARS冠狀病毒主要抗原分子的N蛋白相互作用的蛋白有甲胎蛋白A(AHSG)、細(xì)胞色素氧化酶(CYP4F3)和甘露糖結(jié)合凝集素相關(guān)的絲氨酸蛋白酶(MASP2)。本項(xiàng)研究以上述蛋白的基因作為候選基因,采取病例-對照關(guān)聯(lián)研究的策略對SARS的遺傳易感基因進(jìn)行了篩查,以期對揭示疾病的發(fā)病機(jī)制、提高疾病的預(yù)防、診斷和治療水平提供理論基礎(chǔ)。 本研究先對三個候選基因的外顯子區(qū)、5'和3'側(cè)翼區(qū)及外顯子和內(nèi)含子的交界區(qū)進(jìn)行了重測序,并應(yīng)用Haploview軟件構(gòu)建連鎖不平衡模式,選擇tag SNP和有潛在功能的位點(diǎn)進(jìn)行關(guān)聯(lián)研究。入選的病例-對照按地區(qū)來源分三個人群:北京非醫(yī)源性SARS病例(272例)收集于小湯山醫(yī)院,正常對照(424例)來自北京307醫(yī)院等醫(yī)院健康體檢人群。廣州非醫(yī)源性SARS人群(67例)收集于廣州第八人民醫(yī)院,正常對照(192例)收集自廣州軍區(qū)總醫(yī)院體檢人員。廣州醫(yī)源性人群收集于廣州中山大學(xué)二院醫(yī)務(wù)工作人員(病例40例,正常對照122例)。非醫(yī)源性病例339例均為漢族群體的散發(fā)病例,非醫(yī)源性對照樣品616例采自醫(yī)院體檢正常的漢族人群。對選擇的SNP位點(diǎn)應(yīng)用SNPstream技術(shù)進(jìn)行了基因分型。然后登記分型數(shù)據(jù),進(jìn)行哈溫平衡檢驗(yàn),分別經(jīng)χ2檢驗(yàn)分析組間的等位及基因型分布的差異,對于χ2檢驗(yàn)存在顯著性差異的位點(diǎn)進(jìn)行Logistic回歸分析,以校正年齡、性別因素的影響。應(yīng)用熒光素酶活性檢測對陽性關(guān)聯(lián)位點(diǎn)進(jìn)行了部分功能驗(yàn)證。應(yīng)用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。 主要獲得以下結(jié)果:(1)建立了SNP分型和遺傳分析的技術(shù)平臺。(2)首次發(fā)現(xiàn)AHSG啟動子區(qū)-799A/T多態(tài)性位點(diǎn)及外顯子區(qū)的rs4917和rs1071592位點(diǎn)的等位及基因型頻率在非醫(yī)源性病例和對照中存在顯著的統(tǒng)計學(xué)差異。攜帶至少一個-799T(AT和TT)或rs4917T(CT和TT)等位的個體其患病風(fēng)險分別高于攜帶-799AA或rs4917CC基因型的個體(OR=2.44, 95%CI=1.32-4.57, P=0.005; OR=1.59, 95%CI=1.21-2.08, P=0.001)。功能研究支持AHSG多態(tài)性位點(diǎn)與SARS-CoV感染的易感性相關(guān)聯(lián)。已知AHSG是一種多功能蛋白,低水平AHSG與急性炎癥有關(guān),高水平的AHSG可抑制TNF-α的產(chǎn)生;AHSG還參與巨噬細(xì)胞的滅活,提高細(xì)胞攝取陽離子的能力以減少炎癥因子如TNF-α、IL-1β和IL-6對細(xì)胞的損害。功能研究顯示-799A/T處于轉(zhuǎn)錄因子AP-1結(jié)合區(qū),與-799A相比,-799T與AP-1具有更強(qiáng)的結(jié)合能力,熒光素酶活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,-799A等位型比-799T等位型的轉(zhuǎn)錄活性高出1.86倍。經(jīng)檢測病例和對照個體血清中AHSG的含量,結(jié)果顯示SARS病人AHSG含量顯著低于正常對照。因此推測攜帶-799T等位的個體由于AHSG轉(zhuǎn)錄活性低及血清中AHSG的水平低,因而更易感染SARS-CoV。(3)揭示CYP4F3基因啟動子區(qū)多態(tài)性位點(diǎn)-903A/G、-815A/G、-140C/T和位于內(nèi)含子區(qū)的rs4646519以及由3個啟動子區(qū)SNP位點(diǎn)構(gòu)建的單體型[AGT]的頻率在非醫(yī)源性病例和對照中存在顯著的差異。攜帶基因型-903AA或至少一個-815G(AG和GG)或-140T(CT和TT)等位的個體其發(fā)生SARS-CoV感染的風(fēng)險分別顯著高于攜帶-903GG、AG或-815AA或-140CC基因型的個體(OR=1.41, 95%CI=1.05-1.90,P=0.022;OR=1.81,95%CI=1.36-2.44,P=0.0001;OR=2.44, 5%CI=1.78-3.42, P=0.0001)。單體型分析顯示,攜帶由啟動子區(qū)三個位點(diǎn)的風(fēng)險等位組成的單體型[AGT]的個體患病風(fēng)險顯著高于其它單體型。已知CYP4F3的重要功能是介導(dǎo)炎癥介質(zhì)白三烯B4 (LTB4)的氧化。LTB4是中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中花生四烯酸5-脂肪氧化酶的代謝產(chǎn)物,具有極強(qiáng)的中性粒細(xì)胞趨化和增活功能。如果CYP4F3的含量較高導(dǎo)致炎癥因子LTB4在血液中的含量過低,不能激起有效的炎癥反應(yīng),導(dǎo)致機(jī)體血管系統(tǒng)等的活體組織無法對病毒或其他損傷因子產(chǎn)生防御反應(yīng)。檢測單體型轉(zhuǎn)錄活性結(jié)果顯示單體型[AGT]與其他單體型相比轉(zhuǎn)錄活性最高。-140C/T位于CYP4F3核心啟動子區(qū)-179--90bp內(nèi),-140C等位的轉(zhuǎn)錄活性低于-140T。因此,本研究認(rèn)為攜帶-140T等位的個體由于其高的CYP4F3轉(zhuǎn)錄活性,導(dǎo)致LTB4的含量低,因而更易感染SARS。AHSG基因的陽性關(guān)聯(lián)位點(diǎn)與CYP4F3基因的多態(tài)性位點(diǎn)之間存在交互作用,可協(xié)同增加SARS-CoV感染的風(fēng)險。(4)目前所得資料顯示MBL途徑中的重要蛋白MASP2基因的多態(tài)性位點(diǎn)與SARS-CoV感染的易感性未見有相關(guān)性。 本研究中鑒定的與SARS-CoV感染易感性相關(guān)的基因?yàn)镾ARS疾病高危個體的早期篩查和先期預(yù)防提供了遺傳標(biāo)記,也將有助于疾病發(fā)病機(jī)理的闡明和未來診斷和治療水平的提高。
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號】：R511.9;R346

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：2549987