【摘要】：膿毒癥(sepsis)是感染引起的全身炎癥反應(yīng)征候群,其嚴(yán)重并發(fā)癥—感染性休克(septic shock)是創(chuàng)傷、燒傷和手術(shù)后病人最主要的死亡原因之一。統(tǒng)計(jì)表明,臨床半數(shù)的膿毒癥是由于革蘭氏陰性菌(Gram-negative bacteria)感染引起的,革蘭氏陰性菌的細(xì)胞壁上的脂多糖(lipopolysaccharide,LPS),或稱為內(nèi)毒素(endotoxin),被認(rèn)為是革蘭氏陰性菌引起膿毒癥的主要作用分子。LPS廣泛作用于機(jī)體多種組織器官,其中內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞是最主要的效應(yīng)細(xì)胞,在LPS的刺激下,它們產(chǎn)生大量的細(xì)胞因子,即“細(xì)胞因子風(fēng)暴”(cytokine storm),進(jìn)而引起失控性的炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng),最終引起內(nèi)毒素休克、組織損傷和多器官功能障礙(mutiple organ dysfunction syndrome,MODS)。 肝臟是體內(nèi)物質(zhì)和能量代謝中心,也是感染性休克最易受損的器官之一。研究表明:膿毒癥時(shí)肝細(xì)胞線粒體功能損失是肝臟受損的主要原因之一。膿毒癥時(shí)線粒體基質(zhì)鈣超載,大量氧自由基釋放,NO的生成增多,以及各種細(xì)胞因子的直接或間接性損傷作用,使得肝細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)改變,代謝功能障礙,導(dǎo)致肝細(xì)胞凋亡,進(jìn)而出現(xiàn)肝功能障礙和肝衰竭。 LPS信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的啟動(dòng)是內(nèi)毒素致病過(guò)程中的重要環(huán)節(jié)。細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)研究的中心問(wèn)題就是細(xì)胞感受、轉(zhuǎn)導(dǎo)環(huán)境刺激,調(diào)節(jié)代謝生理反應(yīng)和基因表達(dá)的分子途徑。磷酸化修飾本身所具有的簡(jiǎn)單(simplicity)、靈活(flexibility)、可逆(reversibility)的特性以及磷酸基團(tuán)的供體ATP的易得性,使得磷酸化修飾被真核細(xì)胞所選擇接受成為一種最普遍的調(diào)控手段,蛋白質(zhì)磷酸化在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中所起的無(wú)可替代的作用已是人所共知的事實(shí)。蛋白質(zhì)的磷酸化和去磷酸化這一可逆過(guò)程幾乎調(diào)節(jié)著包括細(xì)胞的增殖、發(fā)育、分化、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞凋亡、神經(jīng)活動(dòng)、肌肉收縮、腫瘤發(fā)生等過(guò)程在內(nèi)的所有生命活動(dòng),目前已經(jīng)知道有許多人類疾病是由于異常的磷酸化修飾所引起,而有些磷酸化修飾卻是某種疾病所導(dǎo)致的后果。那么,內(nèi)毒素休克早期究竟線粒體發(fā)生了哪些功能事件?其具體分子機(jī)制如何?目前所知甚少。因此,進(jìn)行內(nèi)毒素休克時(shí)肝細(xì)胞線粒體中大規(guī)模磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)分析對(duì)研究?jī)?nèi)毒素休克的發(fā)生發(fā)展機(jī)制是十分重要的。 以往的研究大多是在已有的工作基礎(chǔ)上對(duì)少數(shù)幾個(gè)細(xì)胞分子進(jìn)行分析,在理論上推導(dǎo)出對(duì)疾病發(fā)生發(fā)展可能具有重要意義的分子,進(jìn)而進(jìn)行深入細(xì)致的功能研究。這是一種傳統(tǒng)的研究策略,其優(yōu)點(diǎn)是研究問(wèn)題集中,容易深入,可以比較透徹地回答一個(gè)點(diǎn)上的問(wèn)題,但是若將這個(gè)結(jié)果放到一個(gè)體系層面上,其功能又變得撲簌迷離,這是由“分析”主導(dǎo)的研究手段的局限所導(dǎo)致的,只有當(dāng)這種“點(diǎn)”的結(jié)果積累得足夠多的時(shí)候,體系的問(wèn)題也會(huì)變得逐漸清晰起來(lái),但這個(gè)過(guò)程一般需要長(zhǎng)時(shí)間的積累。而蛋白質(zhì)組是高度動(dòng)態(tài)的,即使同一細(xì)胞在不同生理或病理環(huán)境中,其蛋白表達(dá)也是不同的,這種差異蛋白往往是某些疾病發(fā)生的標(biāo)志。利用比較蛋白質(zhì)組研究技術(shù),可以批量觀察正常與疾病細(xì)胞(組織)在蛋白質(zhì)表達(dá)譜上的差異,從整體水平上規(guī)�；睾Y選和發(fā)掘潛在的藥物靶標(biāo),以及適用于早期診斷、介入和治療的疾病蛋白標(biāo)志物。但蛋白的功能僅僅從量的變化上分析往往會(huì)限制我們的研究視野,很多重要蛋白質(zhì)的活性是由翻譯后修飾調(diào)節(jié)的,有時(shí)蛋白水平上看不到明顯變化但翻譯后修飾水平已有顯著變化。因此采用定量技術(shù)對(duì)內(nèi)毒素刺激前后小鼠肝細(xì)胞線粒體磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)進(jìn)行差異定量分析,對(duì)探討由于內(nèi)毒素刺激引起的線粒體損傷的分子機(jī)制,尋找一批與內(nèi)毒素休克肝損傷的發(fā)生發(fā)展緊密相關(guān)的高特異性和高靈敏性的生物標(biāo)記物是非常有價(jià)值的。 熒光差異凝膠電泳(difference in gel electrophoresis,DIGE)是一種在2-D電泳之前進(jìn)行熒光染料標(biāo)記蛋白樣品的方法,通過(guò)對(duì)不同的蛋白樣品用不同的熒光染料進(jìn)行標(biāo)記,在同一塊雙向凝膠中可同時(shí)分離多至三種不同的蛋白樣品,并且每塊膠上又引用了內(nèi)標(biāo),內(nèi)標(biāo)的利用進(jìn)一步增加可信度,確保結(jié)果能反映出真實(shí)的生物學(xué)差異,避免了系統(tǒng)誤差實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響,從而能夠?qū)悠烽g蛋白質(zhì)豐度差異進(jìn)行精確分析。DIGE系統(tǒng)最大的優(yōu)點(diǎn)就是整合了CyDye DIGE染料多重標(biāo)記方法與DeCyder 2D差異分析軟件的優(yōu)勢(shì)。 本實(shí)驗(yàn)采用的統(tǒng)計(jì)分析軟件為DeCyder 2D差異分析軟件。該軟件是由GE公司專門針對(duì)Ettan DIGE系統(tǒng)并利用CyDye DIGE Fluor熒光染料的多通道特性研發(fā)出來(lái)的。DeCyder 2D~(TM) 2D軟件是一個(gè)自動(dòng)化圖象分析軟件,它利用共找點(diǎn)檢測(cè)的算法對(duì)Ettan DIGE系統(tǒng)熒光圖像進(jìn)行自動(dòng)檢測(cè)、背景消除、定量、歸一化以及凝膠內(nèi)和凝膠間匹配分析,從而避免了人為因素的影響,消除了不同操作者帶來(lái)的系統(tǒng)誤差。其中,本實(shí)驗(yàn)采用Decyder軟件中DIA和BVA模塊進(jìn)行凝膠圖像分析。不同凝膠內(nèi)分析模式采用配對(duì)比較,以Cy2為內(nèi)標(biāo)計(jì)算比值,通過(guò)Cy3/Cy2及Cy5/Cy2的比率對(duì)應(yīng)每個(gè)蛋白點(diǎn)含量,并對(duì)其進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化計(jì)算。重復(fù)2塊膠用來(lái)計(jì)算每個(gè)蛋白點(diǎn)平均量的改變,并進(jìn)行T檢驗(yàn),計(jì)算P值,設(shè)定P＜0.05為有顯著性差異。 基于上述思考,我們利用LPS來(lái)制作內(nèi)毒素休克BALB/c小鼠模型,采用差速離心結(jié)合密度梯度離心提取和純化了正常組和LPS刺激1 h后的小鼠肝細(xì)胞線粒體蛋白并利用金屬磷酸鹽親和層析樹(shù)脂富集磷酸化蛋白后,采用DIGE技術(shù)對(duì)兩組磷酸化蛋白進(jìn)行分離,建立了相應(yīng)的差異蛋白圖譜。通過(guò)DeCyder 2D差異分析軟件分析后找到差異蛋白點(diǎn)105個(gè),其中表達(dá)上調(diào)的有49個(gè),表達(dá)下調(diào)的有56個(gè)。對(duì)這些差異蛋白點(diǎn)利用MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜儀進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒定,共鑒定出42種蛋白質(zhì)。數(shù)據(jù)庫(kù)搜索發(fā)現(xiàn)有26種蛋白質(zhì)為確證的磷酸化蛋白質(zhì),其中有24個(gè)磷酸化蛋白質(zhì)的功能與線粒體密切相關(guān)。 通過(guò)對(duì)鑒定的蛋白質(zhì)作亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)分析,我們發(fā)現(xiàn)完全定位于線粒體內(nèi)的有5個(gè);既可定位于線粒體內(nèi),又可定位于其它多個(gè)亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的有34個(gè);在其它亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)定位,但是沒(méi)有線粒體定位的有3個(gè)。通過(guò)定位預(yù)測(cè)分析后,我們又對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行功能分析,并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn),我們把這些差異蛋白功能主要?dú)w納為以下5類:參與蛋白質(zhì)和脂質(zhì)代謝;參與能量代謝;參與氧自由基生成調(diào)節(jié);參與細(xì)胞凋亡;參與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。此外,采用String數(shù)據(jù)庫(kù)和軟件對(duì)所鑒定蛋白質(zhì)的相互作用進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)其中27種蛋白具有直接或間接的相互作用,它們之間的關(guān)系可以用一張相互作用網(wǎng)絡(luò)圖來(lái)表示,這為我們進(jìn)一步研究差異蛋白的功能指明了方向。 通過(guò)研究,我們得出以下幾點(diǎn)結(jié)論: 1.首先利用差速離心法結(jié)合密度梯度離心法提取小鼠肝細(xì)胞線粒體,并應(yīng)用透射電子顯微鏡檢測(cè)了所提取的線粒體的形態(tài)和純度,結(jié)果表明該提取方法有效。 2.應(yīng)用金屬磷酸鹽親和層析樹(shù)脂成功富集了線粒體磷酸化蛋白并利用2D-DIGE分離技術(shù)分離了正常和內(nèi)毒素休克早期(LPS 1 h)BALB/c小鼠的肝細(xì)胞線粒體磷酸化蛋白,并建立了相應(yīng)的差異蛋白圖譜。通過(guò)相應(yīng)的軟件分析,得到了105個(gè)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異蛋白點(diǎn)。 3.對(duì)105個(gè)差異蛋白點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜鑒定,去除角蛋白污染峰后,共鑒定出42種蛋白,其中發(fā)現(xiàn)有26種蛋白為已經(jīng)確證的磷酸化蛋白質(zhì)。 4.對(duì)42個(gè)差異蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析發(fā)現(xiàn)完全定位于線粒體內(nèi)的有5個(gè);既可定位于線粒體內(nèi),又可定位于其它多個(gè)亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的有34個(gè);在其它亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)定位,但是沒(méi)有線粒體定位的有3個(gè)。 5.通過(guò)生物信息學(xué)分析把這些差異蛋白功能主要?dú)w納為以下5類:參與蛋白質(zhì)和脂質(zhì)代謝;參與能量代謝;參與氧自由基生成調(diào)節(jié);參與細(xì)胞凋亡;參與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。而且發(fā)現(xiàn)42種蛋白中有27種蛋白有直接或間接的聯(lián)系,構(gòu)成一張相互作用網(wǎng)絡(luò)圖。 該研究方案能夠成功的捕捉到內(nèi)毒素休克早期小鼠肝臟線粒體差異磷酸化蛋白質(zhì)組的變化,這為進(jìn)一步加深我們對(duì)內(nèi)毒素休克早期線粒體功能變化的分子機(jī)制的認(rèn)識(shí)提供了理論基礎(chǔ),為深入研究膿毒癥的發(fā)病機(jī)制及其防治策略提供了新的機(jī)遇。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號(hào)】：R363

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 姜勇;內(nèi)毒素激活內(nèi)皮細(xì)胞的信號(hào)機(jī)制的研究進(jìn)展[J];中華醫(yī)學(xué)雜志;1999年01期

2 郭愛(ài)華;從全身炎癥反應(yīng)綜合征到膿毒性休克[J];中國(guó)危重病急救醫(yī)學(xué);2002年08期

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本文編號(hào)：2548566