【摘要】： 截止到2009年6月2日,高致病性H5N1人禽流感已經(jīng)蔓延到15個(gè)國(guó)家和地區(qū),累計(jì)感染病例433人,死亡262人,死亡率高達(dá)60%。在我國(guó),確診病例38例,死亡25人,死亡率約為65.8%。另外,伴隨著家禽及野生禽類地域分布的變化,目前高致病性H5N1人禽流感病毒已經(jīng)遍及亞洲以及中東、歐洲、北美、非洲的部分地區(qū),其基因型與抗原性不斷變化,哺乳動(dòng)物宿主范圍也在不斷擴(kuò)大�？梢娙饲萘鞲械姆揽匦蝿�(shì)已經(jīng)異常嚴(yán)峻。為此,WHO提出要加快人禽流感疫苗的研發(fā)進(jìn)程,做好技術(shù)儲(chǔ)備工作。 防控高致病性H5N1人禽流感最有效的手段是疫苗免疫。當(dāng)前高致病性H5N1人禽流感疫苗主要集中在滅活全病毒疫苗、裂解疫苗、減毒疫苗等方面的研究。已經(jīng)制備的大流感模式疫苗主要為滅活全病毒和裂解病毒疫苗,實(shí)驗(yàn)證明其安全、有效和穩(wěn)定。然而現(xiàn)有的這類疫苗多為注射免疫,該疫苗可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生較高效價(jià)的特異性抗病毒血清中和抗體,但是對(duì)于其它亞型病毒的免疫保護(hù)效果較差,而且在特殊人群(老人和兒童)免疫效果不十分滿意,疫苗接種方式繁瑣,不利于人群大規(guī)模接種,這些對(duì)其疫苗的研制帶來(lái)了挑戰(zhàn)。近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的透皮免疫無(wú)疑為上述問(wèn)題的解決提供了新的思路。 透皮免疫作為無(wú)針注射免疫途徑中的一種,在預(yù)防流感的大流行方面具有很大優(yōu)勢(shì):提高疫苗的接種速度、增加接種的安全性及依從性、不需要專業(yè)人員等。另外,透皮免疫的有效性也已被證實(shí),但其機(jī)制尚不十分明確,有人提出以下理論:因皮膚中存在大量的抗原遞呈細(xì)胞尤其是朗格漢斯細(xì)胞,攝取并加工抗原,將其遞呈給T和B細(xì)胞,從而激起全身和粘膜免疫應(yīng)答。朗格漢斯細(xì)胞盡管數(shù)量?jī)H占人皮膚細(xì)胞總數(shù)的2%,但其表面積卻占皮膚總面積的25%左右。朗格漢斯細(xì)胞的密度及其抗原遞呈功能無(wú)疑為疫苗的透皮傳遞提供了理想的靶標(biāo)。 本研究選用WHO推薦的H5N1疫苗株-----A/Vietnam/H5N1-PR8/CDC-RG制備的滅活全病毒疫苗抗原,以霍亂毒素(CT)、霍亂毒素B亞單位(CTB)、大腸桿菌不耐熱腸毒素(LT)、MF59、CpG1826、CpG2006為佐劑,以乙醇、丙二醇、二甲基亞砜、維甲酸、油酸為促滲劑,透皮免疫Balb/c小鼠,通過(guò)評(píng)價(jià)其安全性、有效性,從而篩選出有效的透皮免疫佐劑和促滲劑,并對(duì)該透皮疫苗免疫應(yīng)答的效果進(jìn)行觀察。另外鑒于大腸桿菌不耐熱腸毒素不易購(gòu)得的問(wèn)題,本研究還就其制備進(jìn)行了探索。 本研究分為三部分: 1 .高致病性H5N1人禽流感透皮疫苗佐劑的初步篩選:選用A/Vietnam/H5N1-PR8/CDC-RG滅活全病毒疫苗抗原,設(shè)計(jì)以下兩個(gè)方面的實(shí)驗(yàn): (1)佐劑的篩選:以CT、CTB、LT、MF59、CpG1826、CpG2006為佐劑,與50μg抗原充分混合,調(diào)整抗原濃度為1.0μg/μl,以油酸作為促滲劑,透皮免疫Balb/c小鼠,通過(guò)檢測(cè)血清IgG抗體及其抗體亞型、血抑效價(jià)、肺灌洗液、鼻灌洗液、陰道灌洗液中的IgG、sIgA抗體效價(jià),從而初步篩選到兩種有效的透皮免疫佐劑--------CT、LT。 (2)rLT的制備及其生物活性的驗(yàn)證:以E. coli E24377A菌株的基因組為模扳,構(gòu)建表達(dá)載體pET28a-LTA、pET28a-LTB和pET22b-LTB,對(duì)蛋白進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)及純化后,以1:5(n/n)的比例將LTA與LTB混合,最終制得了rLT全毒素,經(jīng)SDS-PAGE、WB、GM-ELISA、CHO細(xì)胞毒性試驗(yàn)以及MALDI-TOF-MS等方法對(duì)其分子量及活性進(jìn)行了驗(yàn)證,還通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)對(duì)其佐劑活性作了驗(yàn)證,結(jié)果表明該方法制備的rLT不僅具有較好的毒性,而且在透皮免疫應(yīng)答過(guò)程中是較好的佐劑,與(1)中使用的LT相比較,佐劑效果相當(dāng)。 2.高致病性H5N1人禽流感透皮疫苗促滲劑的初步篩選:仍然選用A/Vietnam/H5N1-PR8/CDC-RG滅活全病毒疫苗抗原,選用10μg rLT作為佐劑,分別以乙醇、丙二醇、二甲基亞砜(DMSO)、維甲酸、油酸作為促滲劑,透皮免疫Balb/c小鼠,從安全性和有效性這兩個(gè)方面對(duì)這5種促滲劑進(jìn)行了初步評(píng)價(jià),從而初步篩選到三種安全、有效的促滲劑--------油酸、DMSO、維甲酸。此外,還對(duì)促滲劑處理前后的皮膚病理改變情況進(jìn)行了觀察,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明不同的促滲劑對(duì)固有層的紊亂程度差異較大,油酸、DMSO、維甲酸去除角質(zhì)層的效果較好。但因DMSO具有較強(qiáng)的刺激性氣味,在實(shí)際應(yīng)用中難以推廣,因此優(yōu)選油酸和維甲酸作為高致病性H5N1人禽流感透皮疫苗的促滲劑。 3.高致病性H5N1人禽流感透皮疫苗免疫應(yīng)答效果的初步觀察:選用油酸作為促滲劑,對(duì)抗原與佐劑之間的量效關(guān)系進(jìn)行摸索,并對(duì)透皮免疫應(yīng)答的效果進(jìn)行初步觀察。 以不同劑量的抗原—5μg、10μg、25μg、50μg、100μg與不同劑量的rLT 0μg、1μg、5μg、10μg、25μg、50μg、100μg混合吸附后,選用油酸作為促滲劑,透皮免疫Balb/c小鼠,通過(guò)檢測(cè)免疫前后小鼠血清IgG抗體及其抗體亞型、血凝抑制效價(jià),肺灌洗液、鼻灌洗液、陰道灌洗液中的IgG、sIgA抗體效價(jià),從而初步確定抗原劑量與佐劑劑量的最佳配比為抗原(HA含量)50μg,rLT10μg。并將該組的透皮免疫應(yīng)答效果與PBS組、單用抗原組、注射組以及滴鼻組進(jìn)行比較,結(jié)果發(fā)現(xiàn)透皮免疫組的血清IgG抗體效價(jià)以及血抑效價(jià)要明顯高于PBS組、單用抗原組,但是低于注射組和滴鼻組;粘膜免疫應(yīng)答強(qiáng)度與滴鼻組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;同時(shí)ELISPOT實(shí)驗(yàn)結(jié)果還表明高致病性H5N1人禽流感透皮疫苗誘導(dǎo)的CD4+ T細(xì)胞免疫應(yīng)答以Th2型細(xì)胞免疫應(yīng)答為主。由此可見,高致病性H5N1人禽流感透皮疫苗不僅能夠誘導(dǎo)較強(qiáng)的體液免疫應(yīng)答,而且能誘導(dǎo)粘膜免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答。 結(jié)論:在本研究中,從佐劑、促滲劑、抗原、免疫應(yīng)答這四個(gè)方面對(duì)高致病性H5N1人禽流感透皮疫苗進(jìn)行了初步研究。研究發(fā)現(xiàn),在高致病性H5N1人禽流感疫苗透皮免疫的小鼠模型中,初步篩選并確定了透皮免疫佐劑是CT、LT,促滲劑是油酸、維甲酸,抗原劑量與佐劑rLT劑量的最佳配比為抗原50μg,rLT10μg,免疫三次后能夠誘導(dǎo)較好的免疫應(yīng)答效果。此外,成功表達(dá)了大腸桿菌不耐熱腸毒素,并且通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明其具有較強(qiáng)的毒性和較好的佐劑效果。另外,實(shí)驗(yàn)結(jié)果還表明透皮免疫不僅能夠誘導(dǎo)較好的體液免疫應(yīng)答,而且能夠誘導(dǎo)粘膜免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答,從而為高致病性H5N1人禽流感透皮疫苗的研究奠定了良好的基礎(chǔ),同時(shí)也為其它透皮疫苗的研究提供了思路。
【圖文】：

pET28a(+)表達(dá)的 LTA、LTB 的純化L 經(jīng)誘導(dǎo)的 pET28a(+)-LTA、pET28a(+)-LTB 重組質(zhì)，沉淀用細(xì)胞裂解液重懸，冰浴超聲破碎，4℃ 14000 ；中經(jīng)過(guò)洗滌、溶解處理后，稀釋到蛋白濃度為 5-10m℃17000r/min 離心 15min,取上清，將上清用 0.22μm E 公司的 HiTrapTMQ High Performance 柱和 HiTr 柱分別對(duì) LTA 和 LTB 進(jìn)行純化，，方法參照其純化手冊(cè)化。pET22b(+)表達(dá)的 LTB 的純化L 經(jīng)誘導(dǎo)的 pET22b(+)-LTB 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的大腸桿菌H4)2SO4沉淀法收集培養(yǎng)基中的蛋白。×PBS（pH6.5）重溶蛋白，然后選用 GE 公司的 HiT 柱對(duì) LTB 進(jìn)行純化。

圖 1-2 重組表達(dá)質(zhì)粒 pET28a(+)-LTB 構(gòu)建圖Figure 1-2 Structural map of recombinant plasmid pET28a(+)-LT
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號(hào)】：R392

【引證文獻(xiàn)】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 石穎;噴鼻流感三價(jià)裂解疫苗的制備和免疫效果的初步研究[D];中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2012年

本文編號(hào)：2542667