發(fā)布時間：2019-09-25 07:46

【摘要】： 被公認(rèn)為“超級細(xì)菌”的金黃色葡萄球菌是一種革蘭氏陽性菌,它廣泛地存在于人類的皮膚和粘膜表面。通常金黃色葡萄球菌感染可以用內(nèi)酰胺類、大環(huán)內(nèi)酯類或者喹諾酮類抗生素對其進(jìn)行有效的治療。但是由于抗生素的濫用導(dǎo)致金黃色葡萄球菌產(chǎn)生了廣泛的耐藥性�？股匚C(jī)已經(jīng)成為了全球性的挑戰(zhàn),尋找結(jié)構(gòu)新穎的全新型抗生素的研究已經(jīng)迫在眉睫。 具有毒力因子功能的細(xì)菌表面蛋白正在成為新的抗菌藥物研究的候選靶標(biāo)。研究思想是通過調(diào)控細(xì)菌表面蛋白與宿主的相互作用,干擾細(xì)菌對宿主的入侵感染。SrtA酶是一種膜結(jié)合巰基轉(zhuǎn)肽酶,能識別表面蛋白C端所含的保守氨基酸基序LPXTG(X是指任意的氨基酸),并裂解蘇氨酸(T)和甘氨酸(G)間的肽鍵,產(chǎn)生一個蘇氨酸的羰基末端,與細(xì)胞壁的五個甘氨酸交聯(lián)橋的氨基形成酰氨鍵,從而使表面蛋白被錨定到細(xì)胞壁的肽聚糖上。由于這種酶廣泛存在于很多重要的人類病原菌內(nèi),如單核細(xì)胞增多型李氏桿菌、化膿性鏈球菌、肺炎鏈球菌等,基于轉(zhuǎn)肽酶的作用機(jī)制以及小分子抑制劑的研究,為解決針對金黃色葡萄球菌甚至廣譜的細(xì)菌感染的化學(xué)治療難題必將提供有力的理論依據(jù)。 SrtA酶由206個氨基酸組成,它的N端部分是一個跨膜區(qū),C端部分則是一個催化區(qū)域。SrtAΔN59在體外與SrtA的功能相同,能夠與底物L(fēng)PXTG發(fā)生轉(zhuǎn)肽反應(yīng),催化T和G之間的斷裂。根據(jù)已知SrtA的基因序列,我們設(shè)計了兩對SrtAΔN59基因序列的引物,用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增。其中一個PCR產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶BamhI和SalI雙酶切后克隆到載體pQE30中,另一個PCR產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶NdeI and XhoI雙酶切后克隆到載體pET28b中。在大腸桿菌中表達(dá)重組蛋白SrtAΔN59,并利用AKTA純化儀對其進(jìn)行純化,得到了純度高于90%的SrtAΔN59蛋白。將純化后的SrtAΔN59蛋白濃縮為50mg/ml,采用懸滴法篩選晶體,在Grid試劑盒的D4和D5得到了SrtA的晶體。 為了篩選SrtA酶的小分子抑制劑,我們利用熒光共振能量轉(zhuǎn)移的原理,合成SrtA酶的底物(O-aminobenzoyl -LPATG-diaminopropionic acid-dinitrophenyl-NH2, Abz-LPATG-Dap(Dnp)-NH2)。當(dāng)?shù)孜镏蠰PATG沒有被SrtA酶切斷時,在一定波長的熒光的吸收很弱,但當(dāng)其被SrtA酶切斷后,則在此波長的熒光吸收將會大大增強(qiáng)。在篩選SrtA酶抑制劑的過程中,我們通過監(jiān)測酶抑制反應(yīng)后的熒光吸收值來判斷小分子化合物的活性。最后我們篩選出3個具有較強(qiáng)的抑制活性,它們的IC50值分別為126.82μM、138.26μM和192.85μM。這項研究為以后SrtA抑制劑的發(fā)現(xiàn)和它們之間構(gòu)效關(guān)系的分析奠定了基礎(chǔ)。
【圖文】：

使人或動物致病[52]。Mazmanian 等[41]以金黃色葡萄球菌 A 為模型，研究了表面蛋白 A 的錨定過程。表面蛋白 A 的保守氨基G 片段、一個疏水區(qū)域和尾部帶電荷的氨基酸殘基，這三個部分組成了酸殘基的 C 端信號肽部分，被稱為細(xì)胞壁分選信號(cell wall sorting s1 所示，N 端的特征信號肽則可以幫助表面蛋白分泌到細(xì)胞膜外[53]。

圖 2 SrtA 酶催化表面蛋白錨定過程[56]Fig.2 Sortase catalyzed surface protein attachment[56]1：肽聚糖前體物 lipidII 在細(xì)胞質(zhì)中合成；2：SrtA 將表面蛋白前體物中的分選信號斷裂，并與斷裂的分選信號形成�；钢虚g體；3：中間體受到 lipidII 中肽橋的親核攻擊，與之形成酰胺鍵；4、5：lipidII 與表面蛋白連接后經(jīng)過轉(zhuǎn)糖苷作用和轉(zhuǎn)肽作用形成成熟的肽聚糖，，從而表面蛋白錨定到細(xì)胞壁的肽聚糖上。4.3 SrtA 的三維結(jié)構(gòu)為了能夠分析 SrtA 的活性和結(jié)構(gòu)，我們需要得到高純度的可溶 SrtA 蛋白，但是全長的 SrtA 蛋白的可溶性和穩(wěn)定性都很差。Ton-That[54]發(fā)現(xiàn)將 SrtAN 端的信號肽部分用 6 個組氨酸進(jìn)行替代，大大增強(qiáng)了 SrtA 的可溶性和穩(wěn)定性，活性與原型基本保持一致。Ilangovan[45]等首先對 SrtA 的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行了初步探索，他們將SrtA 酶的 N 端截去 59 個氨基酸殘基后得到 SrtAΔN59，并采用 NMR 衍射技術(shù)得
【學(xué)位授予單位】：揚州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R378

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本文編號：2541321